一文详述：CAR |
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一文详述：CAR
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近年来，随着肿瘤免疫学与基因工程的技术革新，市场规模的快速增长，免疫细胞治疗已成为全球医药行业新药研发的热门领域。特别是CAR-T细胞治疗的横空出世，其强大的抗肿瘤治疗效果，为肿瘤免疫领域带来了革新，为更多的肿瘤患者带来了希望。 生产CAR-T细胞疗法的主要步骤包括最初分离和富集T细胞、T细胞活化、使用病毒或非病毒载体系统进行CAR基因转移、体外CAR-T细胞扩增，以及最后的末端工艺和冷冻保存，整个制造周期一般需要2～4周。 ▲ CAR-T生产的各个阶段和工艺方案示例（图片来源：Cytotherapy） CAR-T细胞的生产失败率范围在2-14%，失败的原因主要来自细胞的个体差异、细胞数量以及细胞质量。为最终实现CAR-T的商业化，努力优化和质量控制生产过程的各个环节都十分重要。面对不同肿瘤患者复杂的样品来源，如何实现高效率、标准化、规模化的生产制备，在工艺上又可以通过哪些手段或方案来满足预期的商业化需求，是CAR-T制造商共同关注的问题。  ▲ CAR-T疗法的局限（图片来源：Nature Reviews Cancer）01 细胞分离和激活 1.1 细胞分离生产CAR-T的第一步，是通过白细胞分离术从患者 （或同种异体的供体） 处收集外周血单核细胞 （PBMC） ；然后利用基于磁珠的技术分离出特定的T细胞亚群，如CD4+、CD8+、CD25+或CD62L+T细胞。 过程中既要考虑分离得到尽可能多的T细胞（回收率要高）；同时要将粒细胞、红细胞、抗凝剂等对后续细胞生产有影响的杂质去掉。譬如，抗凝剂在后续的细胞激活过程中会改变细胞的特征、红细胞会影响产品的临床效果等。 ▲ CAR-T细胞分选（图片来源：Molecular Therapy）在细胞处理的过程中采用封闭式、自动化的系统已成为行业共识。这对于大规模生产制造以及生产工艺的改进是非常必要的，封闭式、自动化的系统不仅可有效缩短细胞处理和分析的时间并提高效率，还能够减少人员接触，节省劳动力的同时也使跟踪过程更容易。使用传统手工开放式的方法进行操作，制造周期很长，结果的稳定性较差。除此之外，污染是手工开放式方法最大的风险。患者血液样本中的T细胞数量有限，而且细胞治疗产品的终产品不能进行除菌过滤，操作过程中一旦出现污染将是难以挽救的。  ▲ CAR-T细胞分选（图片来源：Molecular Therapy）
赛默飞世尔科技
专门的自动化、封闭式、模块化多功能细胞处理系统Gibco™ CTS™ Rotea™逆流离心系统是非常有特色的产品，它可以用在细胞治疗生产过程当中多个步骤，包括细胞的分离、换液浓缩和洗涤等，是应用非常灵活的细胞处理系统。系统内置用户可编程的软件、大量细胞处理的应用程序，以及用于从科学研究到商业化生产的实用程序。 Gibco™ CTS™ Rotea™逆流离心系统独特的腔室设计，可以达到非常低的输出体积
（5 mL）
，灵活地兼容下游的应用和处理。除此以外，它还可以保障优异的细胞回收率
（> 95%）
和活性，同时能够轻松的整合到GMP的生产过程当中，实现从科研到商业化生产的转化。  ▲ Gibco™ CTS™ Rotea™逆流离心系统
Gibco™ CTS™ Dynabeads™ CD3/CD28 磁珠, 提供可靠的技术平台用于免疫治疗中的分离，活化，和扩增T细胞。 ▲ Gibco™ CTS™ Dynabeads™ CD3/CD28 磁珠
1.2 细胞激活 T细胞的激活通过T细胞受体
（Signal 1）
和CD28、4-1BB或OX40等共刺激信号
（Signal 2）
，产生主要的特异性信号来实现。自体抗原呈递细胞，例如树突状细胞
（DC）
，是T细胞反应的内源性激活剂。然而，DC的效力因患者而异，很难作为T细胞激活的可靠来源。 激活会触发细胞分裂，从而促进基因转导，故细胞的激活方式与之后的基因转导效率息息相关。CD3/CD28抗体偶联的超顺磁微珠，例如Dynabeads，是目前用于T细胞活化最广泛使用的平台之一。 ▲ 图片来源：赛默飞世尔科技 CD3/CD28抗体磁珠Gibco™ Dynabeads，是可用于离体分离、活化和/或扩增T细胞的可靠技术。无论是对于多克隆T细胞、抗原特异性T细胞、基因修饰T细胞，调节性T细胞还是其他T细胞亚型，Gibco™ Dynabeads都能使T细胞恢复到具有与体内活化T细胞相当的特性，并确保T细胞保持活力，以用于下游免疫肿瘤学分析。 使用Gibco™ Dynabeads磁珠刺激CD3/TCR和CD28信号转导途径，其活化和扩增高度一致，无需自体抗原呈递细胞 (APC)、有丝分裂原、抗原或饲养层细胞，并能够保留细胞因子谱和完整TCR，人和小鼠T细胞均可适用。 ▲ Gibco™ Dynabeads磁珠 02 细胞改造 实现CAR在T细胞上的表达，是CAR-T生产的核心技术，这一步需要利用到载体将CAR基因导入T细胞。理想的载体应该具有较高的基因转染效率、稳定性好，不引起机体免疫反应等特点。 目前有多种方法用于T细胞修饰，包括病毒载体转导 （如γ-逆转录病毒、慢病毒载体等） 及非病毒载体转染 （转座子转染、电穿孔等技术等） 。 已上市的5款CAR-T产品以病毒载体转导的方式为主，吉利德旗下Kite的Yescarta和Tecartus采用了γ-逆转录病毒载体，其它3款基于慢病毒载体开发，分别是诺华的Kymriah、Juno的Breyanzi，以及百时美施贵宝/bluebird bio的Abecma。 2.1慢病毒慢病毒 （LV） 载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而实现目的序列的持久性表达。相比于其它病毒载体，使用LV载体的优势包括其可携带相对较大的负载，且遗传元件仅在整合后才有活性；因此，可相对简单地达到所需的滴度以及获得单个整合元件。 用于将CAR转导进T细胞的LV载体，是CAR-T细胞生产过程中的关键原材料。LV规模化生产的产能、成本、质量等各方面都将直接影响着CAR-T产品最终的治疗应用。 最终的CAR-T细胞产品需“个体化”来自于每个患者，但编码CAR的病毒载体可以大量地生产，并在-80℃长时间储存。LV载体多采用三质粒或四质粒瞬时转染包装细胞 （如293 T/17或293 T细胞） 的方法进行制备，制备周期一般为2周。 ▲LV载体制备（图片来源
：Methods in Molecular Biology）
LV生产的上游工艺主要包括细胞培养
（分为悬浮/贴壁培养等）
和病毒包装；下游工艺一般涉及澄清、纯化、过滤、浓缩、除菌等步骤。与细胞分离步骤一样，载体的无菌性至关重要，因为最终的CAR-T细胞产物无法通过过滤进行灭菌。 ▲Oxford BioMedica为诺华Kymriah代工的慢病毒制造流程（图片来源：Molecular Therapy） 目前主要存在的挑战包括LV成本高、收率低、活性容易丧失等。LV生产成本高也是CAR-T定价持高不下的一个主要原因，因此，高成本效益的LV生产对于满足商业需求并平稳过渡到临床生产规模至关重要。 Gibco™ LV-MAX™慢病毒系统
是首套完整的悬浮液生产系统，与使用聚乙烯亚胺（PEI）的慢病毒生产方法相比，该系统产量可提高十倍之多，成本降低一半以上。Gibco™ LV-MAX™慢病毒生产系统能够达到>1 x 10^8 TU/mL
（未浓缩）
的高滴度，提供研究级及Gibco™ CTS™ LV-MAX™慢病毒生产系选择，后者既符合GMP医疗器械标准
（21CFR第820部分）
，同时遵守美国药典USP **和欧洲药典Ph. Eur. 5.2.12建议。 ▲ Gibco™ CTS™ LV-MAX™ 慢病毒生产系统 2.2 基因编辑 目前已上市的 CAR-T细胞和大部分在研细胞免疫疗法仍然属于自体疗法。然而，自体疗法存在着成本高、等待时间长、T细胞质量参差不齐、治疗实体瘤效果不明显等局限性，这也使得同种异体
（也称为“现货型”、“通用型”）
CAR-T的开发显得尤为必要。 基因编辑技术可以实现外源基因的靶向插入或内源基因的定向敲除，精确构建CAR-T细胞，已在同种异体CAR-T疗法的开发中被广泛使用。基因编辑应用于同种异体CAR-T，可以限制移植物抗宿主病
（GVHD）
和免疫排斥反应的发生，同时也能够实现CAR-T细胞功能的增强。 ▲ 利用CRISPR/Cas9构建同种异体CAR-T（图片来源：Human Vaccines & Immunotherapeutics） CRISPR/Cas9是现在应用最广泛，研究最深入的基因编辑工具。与TALENs和ZFNs相比，CRISRP/Cas9的精确性更高，能降低脱靶效应带来的副作用，且更利于规模化生产。 从生产过程来看，同种异体CAR-T与自体CAR-T大体上类似，不同点在于同种异体CAR-T的原材料来自健康供者而非患者；另外，采用基因编辑的同种异体CAR-T生产过程中，增加了引入基因编辑工具改造特定基因的一步。 ▲ 同种异体CAR-T的生产（图片来源：Nature Reviews Drug Discovery）
基因编辑应用于T细胞改造的递送方法包括慢病毒、腺病毒、AAV等病毒载体递送；使用质粒或者核糖核蛋白RNP电转；使用编码Cas9的mRNA与sgRNA共电转等。然而，需要注意的是，优化这些方法的转导效率仍是基因编辑CAR-T需要改进的方向，也是降低同种异体CAR-T生产成本、扩大生产规模的重要因素。 ▲ 基因编辑技术在CAR-T改造中的应用（图片来源：Briefings in Functional Genomics） Gibco™ TrueCut™ Cas9蛋白（CTS™-Prototype）
是一种用于临床前研究的Cas9蛋白新标准，现已上市销售，可作为工艺过程开发期间进行临床前研究和评价的早期测试材料。它专为临床前研究的严格要求而设计，并按照严格的指导原则进行生产，可确保质量和一致性，同时，其市场领先性能可与已在多家细胞治疗公司的临床项目中得到应用的Invitrogen™ TrueCut™ Cas9蛋白v2相媲美。
 ▲ Gibco™ TrueCut™ Cas9蛋白（CTS™-Prototype） 2.3电穿孔电穿孔是最早和应用最广泛的非病毒转染策略之一。一个短的电脉冲作用于细胞，以产生暂时的通透性，并允许编码目的基因的DNA或RNA的注入。利用电穿孔进行mRNA转移的转导效率多在90%以上，且设计相对容易，性价比高。 除此之外，利用mRNA电穿孔介导CAR基因表达，可能相比病毒转导更为安全。与通过病毒转导或质粒DNA转染引入转基因的稳定和永久表达不同，mRNA转移提供了一种胞质表达系统，可使T细胞实现CAR基因的瞬时表达。在此过程中，目前还没有证据表明mRNA会整合至人体基因组中，因此，插入诱变的可能性非常低，也不会产生具有复制能力的病毒
（RCR/RCL）
。 Invitrogen™ Neon™ 电转染系统
是新一代高效转染原代、干细胞和难转染细胞的电穿孔装置，具有灵活性、简易性和通用性等优势，让研究人员广泛受益。
 ▲Invitrogen™ Neon™ 电转染系统 03 细胞扩增和洗涤 通过基因修饰获得稳定的CAR-T细胞后，还需要进行大规模的体外扩增，才能获得达到治疗所需剂量，一般为十亿至百亿级别 （根据患者体重和治疗周期决定） 。扩增T细胞仍是CAR-T疗法的关键挑战之一，有许多患者最终无法接受该疗法，原因就在于这些患者的T细胞无法在体外充分扩增，未达到目标剂量。 ▲CAR-T细胞培养和洗涤（图片来源：Molecular Therapy） 细胞可以通过不同的容器进行扩大，包括T瓶、平板或培养袋以及生物反应器。利用摇摆式生物反应器
（例如WAVE）
进行扩增，是目前主要的培养方式；除此之外，自动化的细胞生产设备
（例如CliniMACSProdigy）
也能够生产出大量的CAR-T，这种自动化的设备比起摇摆式生物反应器能大大减少人为操作。 ▲CAR-T生产的多种途径（图片来源：UCL） CAR-T细胞的扩增环节还可以从培养基的使用上去优化。传统的人血清培养基价格昂贵、批间差异大、检测难，并且可能包含新出现的感染问题，以及可能对T细胞扩增和存活有害的物质。 无血清培养基是一个很好的选择
，用来源和化学成分非常清晰的原料，代替血清为宿主细胞提供营养，可以降低被外源物质污染的风险。成本方面，采用血清代替物培养的细胞，其繁殖能力和生长能力等参数能够达到与血清培养的细胞相当，但成本降低了很多。 赛默飞的细胞培养基和试剂能够最大程度地减少污染和变异的风险，同时提供大量的可追溯性文档（包括FDA药物主文件和法规支持文件）用于监管审查，从而促进从研究到商业化的无缝过渡。此外，赛默飞设计了具有灵活性和适应性的生物工艺容器，以便满足适用于封闭式系统的培养基和试剂的需求。 ▲ Gibco™ CTS™ AIM V™ 无血清培养基 04 质量监控 目前，细胞治疗产品的质量控制分为四个大的方面，分别为安全性、纯度、效力以及均一性，这些质量控制会贯穿CAR-T生产的各个阶段。 安全性除了常规的内毒素、支原体及无菌外，如果采用病毒载体进行转导，还需保证病毒的高质量，避免存在RCR/RCL、低风险的整合特征等风险。 CAR-T的效价主要指T细胞的激活程度，由于T细胞的激活涉及一系列的细胞因子以及癌细胞的杀伤，因而真实效价往往难以获得。通常会选取有代表性的指标，如IFN-γ的表达，来评估T细胞的激活。 CAR-T的均一性和纯度则要对不同的细胞表面标志物进行检测，包括CAR-T细胞中的非目标细胞成份和杂质并限定其比例，包括NK细胞等；以及用于鉴别CAR-T细胞中目标T细胞的比例，例如%CD3+T细胞等。 ▲ CAR-T放行检验示例（图片来源：Cytotherapy） CAR-T细胞的有效扩增和较长时间的体内存活是肿瘤治疗有效的先决条件
。监控CAR-T的细胞增殖活性，让治疗持续性发挥效能。接着是CAR-T细胞的杀伤活性评估，CAR-T专一杀瘤效力也是CAR-T治疗关键的一环。除此之外，不容忽视的是治疗过程中可能引发的细胞因子风暴等免疫反应，常用的评估方式为流式细胞术与显微成像技术，和细胞因子等蛋白分析产品。 Invitrogen Attune NxT
是一款高度智能化的流式细胞分析仪，具有专利声波聚焦技术、专业防堵塞、稀有细胞超灵敏高通量分析、顶级平顶光斑激光器等优势，其配置可达4激光16参数，并且可配备流式自动化工作站，实现24小时无人值守自动上样。
 ▲ 流式细胞术 赛默飞的Pierce显色内毒素定量试剂盒是一种高灵敏度的终点测定试剂盒，可使用变形细胞裂解物测定试剂盒准确测量并检测蛋白、肽、核酸或抗体样品中的内毒素（脂多糖）。该试剂盒可在 0.01–0.1 EU/mL 至 0.1–1.0 EU/mL 的两个线性灵敏度范围内进行检测。 ▲ Pierce显色内毒素定量试剂盒05 冻存 细胞扩增完成后，最终可能将达到~5L体积。标准流程中，回输给患者前CAR-T细胞需浓缩至一定体积并进行冻存。冻存的步骤能够允许灵活安排患者的输液时间，以完成审查和放行所需的扩展质量控制测试。 采用经过验证的冻存方法对于大规模生产至关重要，从产品质量角度来看，冻存环节直接关系到最终回输给患者时的状态和数量，需要稳健的工艺支持，避免细胞活性变差、细胞数量损耗、污染的发生。 因此，选择简单易操作、可更好保护细胞活力的细胞冻存液尤为重要。赛默飞提供Gibco™CTS™ Synth-a-Freeze™ 冻存液，从基础科学研究到临床研究都能够适用。Gibco™CTS™ Synth-a-Freeze™ 冻存液是一种化学成分明确、不含蛋白成分的液体冻存培养基，用于冷冻和储存各种哺乳动物细胞，包括干细胞。其操作简单并适用于当前的冻存方案，只需将该产品解冻后添加到分离和沉淀的细胞中，等分并冷冻即可。 ▲Gibco™ CTS™ Synth-a-Freeze™ 冻存液 无论使用何种制造模式，成功的CAR-T细胞生产依赖于整体流程的优化能力，包括流程的简化、产能的规划、生产的合规性和可扩展性等。 ▲ CAR-T生产各环节的挑战和解决方案（图片来源：Cytotherapy） 参考资料：
1. Levine, B., Miskin, J., Wonnacott, K. and Keir, C., 2017. Global Manufacturing of CAR T Cell Therapy. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development, 4, pp.92-101.2. Roddie, C., O'Reilly, M., Dias Alves Pinto, J., Vispute, K. and Lowdell, M., 2019. Manufacturing chimeric antigen receptor T cells: issues and challenges. Cytotherapy, 21(3), pp.327-340.
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