在RNA-seq上游的流程中，所得到的产物为表达矩阵，一般指通过RSEM、HTseq等量化工具统计得到的，各个样本比对到参考基因组中各个基因的reads数，一般成为raw read count，这也是最简单的表达定量形式。

但是在分析不同样本中基因的表达量时，使用raw read count是不够严谨的，往往还需要进行表达矩阵的归一化处理，这种处理需要的解决的问题如下：

1.目标基因的转录本长度，长度越长的转录本对应能够mapping上的reads数也越多，无法反映该基因实际的表达情况

2.总的有效比对的reads数量，即去除没有mapping上的，或者匹配不准确的reads，显然测序深度越深，总的有效比对的reads数量越多，每一个基因对应mapping到的reads数量也越多

Coverage ratio（覆盖比率，亦简称覆盖率，亦称基因组覆盖率），指被测序到的碱基占全基因组大小的比率。

Coverage depth (覆盖深度，亦称测序深度，或者碱基平均测序深度)，指每个碱基被测序的平均次数。即测序的数据总量比基因组大小

3.测序的偏差

方法一：RPKM

RPKM: Reads Per Kilobase of exon model per Million mapped reads (每千个碱基的转录每百万映射读取的reads)

将raw counts除以改样本总的有效的（匹配上的）reads数（以KB为单位），以减少测序深度的影响；再除以该基因的转录本长度（以百万为单位），即真核生物外显子长度和、原核生物编码区长度和，以减少基因长度的影响 。

在single-end测序中，一个read就是一个read。而在pair-end测序中，若一对paired-read 都比对上了，当做两个read；若只有一个read比对上，另一个未比对上，当做一个read计算。

 局限性：该算法除以有效比对的reads总和的这种方式，排除了测序深度对总reads数的影响，但是没有考虑到基因转录本长度对reads总和的影响，可以说RPKM是先进行测序深度标准化，后进行基因长度标准化。为了排除转录本长度对reads总和的影响，应当首先进行基因长度标准化，载根据长度标准化后的reads总和进行测序深度的标准化，TPM算法应运而生。

方法二：TPM

TPM：Transcripts Per Kilobase of exon model per Million mapped reads (每千个碱基的转录每百万映射读取的Transcripts)

TPM是先根据基因长度矫正count值，即用count值除以基因长度（百万为单位）得到矫正后的reads数，将所有校正后的count值相加得到矫正后的总counts值，将校正后的count值除以校正后的总count值，得到TPM值。

方法三：FPKM

FPKM: Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped fragments(每千个碱基的转录每百万映射读取的fragments)

一般是针对双端测序的方法

在single-end测序中，FPKM将read当做fragment计算，此时FPKM和RPKM是相同的。而在pair-end测序  中，  若一堆paired-read 都比对上了，当做一个fragment。

方法四：RPM/CPM

RPM/CPM: Reads/Counts of exon model per Million mapped reads (每百万映射读取的reads)

RPM（CPM）是指将count数除以总有效匹配的count数，以排除测序深度的影响，常常用于长度差异不大的sRNA的分析

参考链接：​​​​​​对FPKM/RPKM以及TPM的理解 - wangchuang2017 - 博客园

TPM、RPKM与FPKM相互转换 - 简书 (jianshu.com)

RPKM简介 | Public Library of Bioinformatics (plob.org)