今天我们来学习环状circular RNA。

在此之前我们先来了解下RNA有哪些。2012 年以前，经典教科书和主流观点里，RNA 还是线性的，主要有这 3 类：mRNA、tRNA 和 rRNA，但随着时间的推进，研究的深入，越来越多的 RNA 被发现，除了二十世纪初备受关注的 miRNAs，snRNA，siRNA，LncRNA，还有近年来研究最火热的环状 RNA，与其它传统线性 mRNA 都不同，环状 RNA 具有闭合环状结构。

一、RNA的种类和作用

我们熟悉的RNA有：信使RNA、转运RNA、核糖体RNA。然而根据功能不同，还有很多功能性RNA参与转录调控。

mRNA：信使RNA，mRNA的功能就是把DNA上的遗传信息精确无误地转录下来，拿到核糖体蛋白加工工厂，指导编码蛋白上的氨基酸序列。

pre-mRNA：就是前体mRNA，mRNA的半成品，前体mRNA与成熟的mRNA在分子大小上差别很大，所以也称为不均一核RNA(heterogeneousnuclearRNA，hnRNA)。

snRNA：细胞内有小核RNA。长度在哺乳动物中约为100-215个核苷酸，它是真核生物转录后加工过程中RNA剪接体(spliceosome)的主要成分，参与mRNA前体的加工过程。

tRNA：借由自身的反密码子识别mRNA上的密码子，将该密码子对应的氨基酸转运至核糖体合成中的多肽链上。

rRNA：核糖体RNA在核糖体中起装配和催化作用。rRNA是组成核糖体的主要成分。核糖体是合成蛋白质的工厂。在大肠杆菌中，rRNA量占细胞总RNA量的75%-85%，而tRNA占15%，mRNA仅占3-5%。

snRNA、tRNA、rRNA，就像是蛋白加工工厂流水线上的螺丝钉，各司其职，比较稳定，一般不作为研究对象。mRNA、miRNA、lncRNA是研究较多的对象。

microRNA（miRNA）:22碱基左右，是内源性非编码小RNA。其实除了mRNA，基本上其它RNA都是非编码RNA，不能决定蛋白的氨基酸序列。miRNA的功能主要是调控RNA的转录，通过结合mRNA导致基因沉默，即可以导致靶基因表达下调。

lncRNA：长度大于 200 个核苷酸的非编码 RNA，在剂量补偿效应、表观遗传调控、细胞周期调控和细胞分化调控中起着重要作用。

siRNA：一类约21~25nt的RNA分子，由Dicer(RNAaseⅢ家族中对双链RNA具有特异性的酶)加工而成，通过完全互补配对的方式与目标mRNA结合，引起其降解，从而导致靶基因沉默。

ceRNA：competing endogenous RNAs，内源竞争RNA，ceRNA可以通过应答元件(microRNA response elements，MREs)与microRNA结合从而影响microRNA导致的基因沉默。

还有一个就是我们接下来要学习的circRNAs

二、circRNAs(Circular RNAs，环状RNA)

circRNAs(Circular RNAs，环状RNA)是一类不具有5’未端帽子和3’末端poly(A)尾巴、由常规基因经过剪切，并以共价键形成环形结构的非编码RNA分子。含miRNA应答元件(miRNAresponse element，MRE)，可充当竞争性内源RNA(competing endogenousRNA，ceRNA)，与miRNA结合，在细胞中起到miRNA海绵的作用，进而解除miRNA对其靶基因的抑制作用，上调靶基因的表达水平。

PS:大多数真核成熟的mRNA分子具有典型的5’-端的7-甲基鸟苷三磷酸（m7GTP）帽子结构和3’-端的多聚腺苷酸(polyA)尾巴结构。circRNAs不具有5’未端帽子和3’末端poly(A)尾巴。

circular RNA研究历程

环状RNA形成

成熟的线性mRNA分子

具有典型的5‘端帽子结构和3’端的polyA尾巴。

图中circular RNA单个外显子成环、2个外显子夹杂内含子成环、多个外显子成环均已经标出；circular RNA三个显著特征：环状结构、无Poly A尾巴、非编码RNA。

相比线性mRNA分子，环状RNA生物稳定性高.环状RNA生物学功能

miRNA海绵：环状可以吸附大量miRNA;蛋白海绵：可以吸附大量蛋白;翻译蛋白。Circular RNA可以翻译成相应蛋白

Circular RNA能够和特定的miRNA结合，从而阻止miRNA去降解特定的mRNA，miRNA的一个重要功能是结合到特定mRNA的3’端，从而降解相应的mRNA。所以Circular RNA和相应的miRNA结合之后就可以调节mRNA的表达。

机制一：ceRNA机制（micro海绵机制）

microRNA 与靶基因的3‘UTR区相结合，抑制靶基因表达；Ago 蛋白和microRNA 结合形成二元复合物，然后被吸附，环状RNA 抢夺microRNA，之前结合在mRNA上的microRNA也会被夺走。

机制二：结合功能蛋白

机制三：m6A修饰

我们通过这一篇高分的综述深入来学习下。

Abstract

环状RNA（CircRNA）是单链共价闭合( single-stranded, covalently closed)的RNA分子，在从病毒到哺乳动物的物种中无处不在。在circRNA的生物发生、调控、定位、降解和修饰方面取得了重要进展。

CircRNA通过充当转录调节剂( transcriptional regulators)，microRNA海绵（miR sponges)和蛋白质模板( protein templates)来发挥生物学功能。

此外，新出现的证据表明，一组circRNA可以作为蛋白质诱饵（decoys），支架（scaffolds）和招募者（recruiters）。然而，现有的关于circRNA-蛋白质相互作用的研究相当有限。因此，本文简要总结了circRNA代谢和功能的研究进展，并详细讨论了circRNA-蛋白质相互作用的模式（circRNA-protein interactions），包括改变蛋白质之间的相互作用、捆绑（tethering）或隔离（sequestering）蛋白质、将蛋白质募集到染色质（chromatin）、形成circRNA-蛋白质-mRNA三元复合物以及蛋白质的易位或重新分配。

许多发现表明，circRNA具有独特的表达特征，并在各种疾病中发挥关键作用，使它们能够潜在地作为诊断生物标志物和治疗靶点。这篇综述系统地评估了circRNA的作用和机制，以期推进涉及circRNA的转化医学。

简介

circRNA于1976年首次被报道为类病毒viroids,，这是某些植物的病原体pathogens，并于1979年通过电子显微镜首次在人HeLa细胞中检测到。后来，更多的研究发现或合成了各种物种的环状RNA，包括病毒viruses，原核生物prokaryotes，单细胞真核生物unicellular eukaryotes和哺乳动物mammals。随着高通量RNA测序和生物信息学工具的发展，科学家们发现circRNA是人类转录组的一般特征，并且在许多其他后生动物（metazoans）中无处不在（ubiquitous）。最近，越来越多的研究已经确定了circRNA的多种功能，包括作为蛋白质支架（protein scaffolds）或miR海绵（miR sponges）并被翻译成多肽。

这种 mRNA 相当于线性 mRNA 分子中的 3’ 和 5’ 端被连接形成了闭合环状结构，失去了 PolyA 尾巴，因此对核酸外切酶不敏感，相较于线性 mRNA，环状 RNA 能够

更加稳定地存在。

与线性RNA相比，circRNA的闭合环状结构为它们提供了更长的半衰期和对RNase R的抵抗力，这使它们成为诊断生物标志物和治疗靶点的潜在候选者。circRNA在多种疾病中有独特的表达特征和关键的生物学作用，例如癌症，心血管疾病，神经系统疾病和自身免疫性疾病。

然而，circRNA异常景观（abnormal landscape）背后的机制以及circRNA如何在疾病中发挥生理或病理作用仍然知之甚少。此外，大多数功能研究表明，circRNA充当miR海绵，单调且刻板（ monotonous and stereotypical）。小脑变性相关蛋白1（CDR1as）的反义转录本代表了最早circRNA的功能研究，并扩展了竞争的内源性RNA（ceRNA）串扰网络。

circRNA机制Metabolism of circRNA

RBP可以通过二聚化，ICS稳定或ICS损伤来调节circRNA生物发生。侧翼内含子中的 ICS 可以促进外显子循环化。Biogenesis of circRNA。

a 在 lariat模型中， back-spliced exons外显子被跳过并挤出，形成一个经历进一步反向剪接（further back-splicing）的内含子分支（an intronic lariat），而其余的外显子直接相互连接，形成成熟的mRNA。

b 在直接模型中，首先发生反向剪接（back-splicing）以形成circRNA，留下含有内含子的未成熟线性RNA。

c长circRNA（>800 nt）或短circRNA可以分别在UAP56或URH49的帮助下转移到细胞质 cytoplasm中。

d CircRNA可以在YTHDC6介导的m1A依赖性方式易位到细胞质中。

e CircRNA可以通过外泌体排泄到细胞外空间。CircRNA的降解。

f 病毒感染后，由2′-5′-寡腺苷（2′-5′A）激活的RNase L引起circRNA的全局降解，从而减轻了PKR的抑制。

g 含有M6A的circRNA可以被YTHDF2识别，YTHDF12与HRSP1桥接的RNase P / MRP复合物相互作用，然后复合物内核糖核溶解切割circRNA。

h UPF3和G1BP可以结合circRNA不完善的碱基配对区域,并诱导其降解。

Functions of circRNA.

a CircRNA可以在其合成位点 synthesis locus与宿主基因结合，并通过形成RNA-DNA杂交体（R环结构）引起转录暂停或终止，上调外显子跳过或截短的转录本。

b EIciRNA可以与U1 snRNP结合，然后与Pol II相互作用以增强亲本基因表达。

c CircRNA可以充当miR海绵并上调miR靶mRNA。

d CircRNA可以与蛋白质相互作用。

e 含有IRES的circRNA可以直接募集核糖体并被翻译。

f 含有M6A的circRNA可以被YTHDF3识别，YTHDF4招募eIF2G3，从而触发翻译。该过程可以通过METTL3/14增强，并通过脂肪量和肥胖相关蛋白（FTO）抑制。

CircRNA-protein interaction

（a）CircRNA与两种蛋白质结合并加强它们的相互作用。

（b）CircRNA与蛋白A结合，并加强其与蛋白B的相互作用，蛋白B不直接与circRNA结合。

（c）CircRNA与最初相互结合的两种蛋白质结合，然后破坏它们的相互作用。

B CircRNA阻断蛋白质与DNA，RNA或其他蛋白质相互作用，从而损害其原始功能( compromising their original functions.)。

C CircRNA将转录因子，染色质重塑剂和DNA或组蛋白修饰酶募集到启动子中并改变转录（包括激活和抑制）。

D CircRNA帮助RBP与mRNA结合并稳定mRNA（间接促进翻译）或直接调节翻译（包括促进和抑制）。

E（a） Nuclear circRNA导致蛋白质的核保留(nuclear retention of proteins)。

（b）细胞质或穿梭的circRNA促进蛋白质的核输入。

（c）细胞质环RNA引起蛋白质的细胞质滞留。

（d） 核或穿梭的circRNA有助于蛋白质的核输出。

（e-g）circRNA可以将蛋白质分别转运到核仁，线粒体和膜。

按作用方式分类的已知circRNA-protein interactions

改变蛋白质之间的相互作用

circRNA-蛋白质相互作用的三种模式：

（1）一种circRNA与两种蛋白质结合并巩固它们的相互作用;

（2）一个circRNA与蛋白A结合，并巩固( cements)或解离(dissociates)其与不直接与circRNA结合的蛋白B的相互作用;

（3）一个circRNA与两种蛋白质结合，这两种蛋白质最初相互结合，解离它们的相互作用。circRNA-蛋白A / B三元（或更多）复合物在所有三种模式下都出现，但效果不同。

根据circRNA对蛋白质的直接影响将它们分为五种模式：

（1）改变蛋白质之间的相互作用;

（2）拴系或螯合蛋白质（ tethering or sequestering proteins）;

（3）将蛋白质募集到染色质中;

（4）形成circRNA-蛋白-mRNA三元复合物;

（5）易位或重新分配蛋白质（ translocating or redistributing proteins）。

目前，circRNA-蛋白质相互作用的研究仍停留在最初级阶段，未达临床阶段。尽管它们独特的结构和对RNA衰变机制的抵抗力使它们能够作为理想的诊断生物标志物和治疗靶点，但遗憾的是，到目前为止，还没有一个基于circRNA的医学应用被批准。

上个月有一篇最新文章，介绍环状RNA疫苗诱导强效T细胞反应，大家可以看看。

Amaya L, Grigoryan L, Li Z, et al. Circular RNA vaccine induces potent T cell responses. Proc Natl Acad Sci U S A. 2023;120(20):e2302191120. doi:10.1073/pnas.2302191120

环状RNA（circRNA）与mRNA相比，不存在帽和尾结构，并且可以防止核酸外切酶降解，使其具有优异的稳定性。

工程化的circRNA具有内部核糖体进入位点（IRES），可不依赖帽的方式翻译蛋白，现有技术可以在体外转录生产大量circRNA，为扩大化临床级生产提供了便利，这些优势使circRNA成为RNA药物领域更优选择之一。

文中系统地介绍了circRNA疫苗在小鼠中的佐剂活性、给药途径和抗原特异性免疫。用电荷改变的可释放转运体（CART）递送工程化circRNA以表达抗原免疫小鼠，可诱导DC的先天激活和淋巴结组织中的抗原特异性CD8 T细胞反应，以及作为治疗性癌症疫苗的抗肿瘤效果。

环状RNA行业现状

Orna是全球首家利用环状RNA（circRNA） 技术开发新疗法的公司。Orna 的发展依赖的就是环状 RNA 技术。

同一时期，环状 RNA 的相关研究逐渐火热。在国外，美国 RNA 技术开发公司 Arraystar 推出全球首款商业化的环状 RNA 芯片；在国内，中科院生物物理研究所的范祖森教授课题组研究了小鼠骨髓细胞中分离的长期造血干细胞和多能干细胞的环状 RNA 的表达谱，曹雪涛院士课题组研究了环状 RNA 在肝癌中发挥的功能。

Orna 的CEO Barnes 表示，“我们的产品更加安全，并且能够重复使用，而且我们从细胞疗法中获得了很多的经验”。

1月5号美国环状mRNA龙头Orna宣布与先声投资集团下属先博生物宣布合作，主要是Orna最快的产品OR1-101， 通过环状mRNA的高稳定性实现更高更稳定的蛋白表达量。

利用环状 RNA 稳定的特性，Orna 开发了 oRNA 疗法，将环状 mRNA 用脂质纳米颗粒递送至体内以治疗疾病。相较于线性 mRNA，环状 RNA 可以折叠成 3D 结构，因此 Orna 能够递送更多的环状 mRNA。

通常情况下，环状 RNA 由于缺乏翻译起始元件——内部核糖体进入位点（IRES），是不编码蛋白质的。2018 年，Orna 联合创始人 Alex Wesselhoeft 博士和他 MIT 的同事就解决了这一问题。

他们先在体外合成具有内部核糖体进入位点的线性 mRNA 分子，然后设计了一个自剪接内含子，该内含子可以在体外有效环化长达 5kb 的 RNA。他们发现，经过优化的环状 RNA 的蛋白质表达量很高，半衰期更长，在某些情况下，其表达蛋白的稳定性远远超过了未修饰的和核苷修饰的线性 mRNA。

RNA环化过程

目前，Orna 计划将这种环状 RNA 递送到不同的位置，包括肝脏细胞和免疫细胞（包括 T 细胞、巨噬细胞、NK 细胞），其中，针对免疫细胞的方式是将嵌合抗原受体（CAR）直接传递至患者体内的免疫细胞。

与传统 CAR-T 细胞制备方式不同，这种免疫细胞疗法无需从患者体内提取 T 细胞进行工程化改造，而是将 CAR 直接递送到患者体内的免疫细胞，包括 T 细胞、NK 细胞、巨噬细胞等。然后将患者的身体作为制备 CAR-T、CAR-NK、CAR-M 等工程化免疫细胞的容器。

文献来源：

Zhou WY, Cai ZR, Liu J, Wang DS, Ju HQ, Xu RH. Circular RNA: metabolism, functions and interactions with proteins. Mol Cancer. 2020;19(1):172. Published 2020 Dec 14. doi:10.1186/s12943-020-01286-3.

来源：Of Studies/ 医药速览 2023-06-19