原标题：一文带你轻松拿捏qPCR引物设计“姿势”

qPCR实验中，引物设计相当关键，有时qPCR检测结果不尽人意有可能是引物不合适。今天小编就来讲讲qPCR引物设计的原则和方法，希望能帮助各位小伙伴解决引物特异性差、扩增效率低等问题。

引物设计原则

1、引物长度一般为15-30bp，与模板的序列紧密互补，过长会导致其延伸温度过高，不利于Taq DNA 聚合酶进行反应。

2、G+C含量一般为40%~60%，过高或过低都不利于寡核苷酸双链解链反应，可以按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估计Tm值，Tm值接近72℃时复性条件最佳。

3、引物中四种碱基的分布最好是随机的，避免出现聚嘌呤或聚嘧啶，尤其3’端不应出现3个以上连续的G或C。

4、两条引物之间及引物自身不应存在互补序列，尤其要避免3’端的互补重叠防止引物二聚体的形成。

5、引物3’端不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能。

6、引物5’端可以被修饰而不影响扩增的特异性。

7、引物3’端不要终止于密码子的第3位。

8、引物设计最好跨内含子设计。

qPCR引物设计方法

第一步：基因查询

以人SND1为例，在NCBI输入基因名称

第二步：找到CDS区

找到对应的转录本，点击NM号

点击CDS跳转页面底部，点击FASTA获取完整序列

第三步：引物设计

获取完整CDS序列后点击右边Pick Primers

进入该界面，红框中的内容根据设计需求修改，点击页面底部Get Primers获得引物设计结果

得到设计结果后，可根据Tm值、CG含量初步筛选合适的引物，同时注意Self complementarity与Self 3' complementarity越小越好

除了上述方法，小伙伴还可以尝试使用https://biodb.swu.edu.cn/qprimerdb/网站进行设计，选择物种后输入NCBI结果中的ENST编码即可获得设计结果。

以上就是qPCR引物设计的详细步骤了，希望对各位小伙伴有所帮助~返回搜狐，查看更多

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