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本产品是用于一管式双链cDNA合成的试剂盒。cDNA第一链合成的原理是以Oligo dT为通用引物的、MMLV催化的逆转录反应。其原理如下：cDNA第二链合成的原理是用RNase H使RNA-DNA杂合链中的RNA产生切口，再用E.coli DNA Polymerase I的切口平移活性进行RNA链取代合成cDNA第二链，其原理图如下： 即开即用，含有合成两条cDNA链的所有试剂，用户只需要提供mRNA。一管式进行，第一链cDNA合成后不需要任何处理，直接进入第二链的合成。所得双链cDNA可以直接用于后续的常规PCR、real-time PCR、cDNA文库构建、抑制性差减杂交等。本试剂盒足够10次80μL体系的双链cDNA合成反应。本产品只能用于科研。成分规格cDNA第一链合成反应液(含Oligo-dT和dNTP)50μLMMLV逆转录酶10μL5×cDNA第二链合成反应液160μL20×cDNA第二链合成酶混合液40μL 超纯水1mL 保存：-20℃保存，有效期一年。一、mRNA的制备本试剂盒不提供mRNA提取试剂，用户需自备相关试剂。 二、双链cDNA的合成 在一个干净的塑料离心管中，按下表设置cDNA合成反应：成分用量自备样品mRNA4μL(0.5～2μg)cDNA第一链合成缓冲液(含Oligo dT引物和dNTP)5μL70℃ 2分钟后室温放置2分钟，短暂离心。MMLV逆转录酶1μL轻柔吹打混匀后42℃保温90分钟合成第一链cDNA。超纯水48μL5×cDNA第二链合成缓冲液16μL20×cDNA第二链合成酶混合液4μL共80μL，吹打混匀后，短暂离心，16℃保温2小时。如果需要将双链cDNA平末端化，则需加自备T4 DNA聚合酶2μL，轻柔吹打混匀后，16℃继续保温30分钟。然后进入下一步。如果不需要将cDNA平末端化，则直接进入下一步。终止反应：如果后续实验(如电泳)不担心EDTA的影响，可以直接加入4μL 0.2M EDTA溶液终止反应，然后将样品放-20℃长期保存。如果后续实验（如PCR扩增）不担心cDNA的单双链状态，可以95℃保温10分钟终止反应。如果后续实验既受EDTA影响，又不能是单链DNA，则可以用PCR过柱纯化法纯化。电泳5μL检测cDNA质量。如果cDNA在0.5～10Kb的范围内呈模糊一片，则cDNA合格。如果没看见cDNA或有其他异常，需查找原因后再继续。所得cDNA可以直接用于后续的常规PCR、real-time PCR、cDNA文库构建、抑制性差减杂交等实验。相关搜索：一管式双链cDNA合成试剂盒，双链cDNA合成试剂盒，One-Tube double-stranded cDNA Synthesis Kit
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