发表杂志：Journal of Hepatology

影响因子：25.083

发表时间：2021年6月9日

高通量测序方法：单细胞测序，外显子测序，转录组测序

样本设置：11例腺癌和2例腺鳞癌原发病例的癌和癌旁组织分别进行单细胞测序；41例腺癌和11例腺鳞癌病例进行免疫组化和免疫荧光验证。通过外显子测序将样本分为ErbB通路突变组（case组）和ErbB通路不突变组（control组）。

研究思路

主要研究结果 1、肿瘤异质性研究

对13例原发病例的癌组织和癌旁组织的26个样本进行单细胞测序，共获得114927个细胞。鉴定到16种细胞类型，分别是上皮细胞，内皮细胞_VEF，内皮细胞_DCN，肌成纤维细胞，CAF_MFAP5，CAF_ACTA2，肥大细胞，滤泡B细胞，浆细胞，Treg，CD4 T细胞，CD8 T细胞，单核细胞，M1巨噬细胞，M2巨噬细胞和DC细胞。对单细胞测序结果和Bulk RNA测序结果进行对照分析显示两者异质性高，说明单细胞测序结果是具有代表性的。不同细胞类型的数目在癌和癌旁具有较大差异，在肿瘤区域，M2巨噬细胞，Treg和上皮细胞的数目更多，而在癌旁区域，CAF_MFAP5，内皮细胞_DCN和单核细胞的数目更多，说明胆囊癌病人中肿瘤内和肿瘤间均具有较大的一致性。

2、上皮细胞亚群分析

绝大多数胆囊癌都是起源于上皮细胞，因此对上皮细胞进行进一步分析。上皮细胞可分为四个亚群，其中亚群1，2，3是腺癌病人特有的，亚群4是腺鳞癌病人特有的。不同亚群的高表达基因和信号通路不尽相同。利用拷贝数变异分析对上皮细胞进行分析结果显示，癌组织具有更高的拷贝数变异。

对四个亚群的上皮细胞进行细胞演化分析结果显示，亚群1在癌旁至癌区域呈现逐渐降低；亚群2则呈现相反趋势。利用拟时序分析针对正常态，中间态，肿瘤态的细胞鉴定其恶变前状态，鉴定到type1和type2的中间态临界点。临界点相对于亚群1高表达了肿瘤促进基因，如MYC，CXCL5等，亚群2相对易临界点2高表达了 ENO1，CDK1等基因。通过该分析找到了肿瘤发生和进化的功能基因。

3、胆囊癌病例的外显子测序分析

与此同时，对上述病例进行了外显子测序分析，发现3个病例的ErbB通路发生体细胞突变，因此，将病例分成ErbB通路突变组（Case组）和ErbB通路无突变组（control组）。

4、ErbB通路突变组和ErbB通路无突变组的差异分析

对两组病例的细胞数目比较发现，case组的Treg和M2细胞等免疫抑制细胞数目增多，并通过另外一个队列的21例case组和20例control组的免疫组化结果进行验证，获得了一致的结果。Case组表达更高Treg marker基因FOXP3和M2巨噬细胞的marker基因CD163，与单细胞测序的细胞数目统计结果一致。

针对case组和control组的细胞通讯分析结果显示，上皮细胞亚群1和亚群2在case 组与Treg，单核细胞以及巨噬细胞的细胞通讯更强。上皮细胞亚群2是在肿瘤区域高度富集的细胞，对这些细胞的分泌蛋白分析显示，CD24，MDK和SERPINA1等在case组的表达更高，这一结果也经过bulk RNA测序进行验证。通过细胞通讯分析显示case组的巨噬细胞通过MDK-LRP1，MDK-SORL1的受体-配体关系与上皮细胞具有强的细胞通讯。

5、MDK-LRP1促进免疫抑制巨噬细胞分化

MDK在肿瘤微环境中有不同的细胞间通讯，鉴于case组具有更多的免疫抑制巨噬细胞，我们推测MDK可能参与了免疫逃逸反应。发现case组的STAT及其下游基因CXCL9和CXCL10在免疫抑制巨噬细胞中的表达以及通过CXCL10-CXCR3与CD4+ T细胞和Treg细胞的通讯高于control组，说明case组的上皮细胞对免疫细胞的免疫逃逸，可能依赖于M2巨噬细胞招募或激活CD4+ T细胞和Treg细胞。

为进一步验证MDK对M2巨噬细胞分化的作用，用MDK重组蛋白以及胆囊癌肿瘤细胞的条件培养基处理巨噬细胞细胞系THP-1，通过细胞形态观察、M2 marker基因的WB，以及流式验证M2巨噬细胞增加。在case组的M1和M2巨噬细胞中高表达MDK的受体LRP1。用LRP1的中和抗体处理PBMC细胞，或在THP1细胞系敲低LRP1，MDK均无法促进THP1的分化。以上结果说明MDK-LRP1参与免疫抑制细胞的分化。

为进一步验证MDK激活的M2巨噬细胞是否招募Treg细胞，用transwell实验（上层培养PBMC细胞，下层培养MDK处理的THP1细胞）进行验证。共培养后的下层细胞可以用流式检测到Treg细胞，说明MDK诱导的M2巨噬细胞可以招募Treg细胞。

最后，对MDK的预后分析结果显示，MDK在case组的表达高，并且MDK的高表达与更低的整体生存率显著相关。免疫荧光实验显示case组高表达MDK，CD163和FOXP3，进一步验证在case组中，MDK促进免疫抑制细胞的浸润以及招募Treg细胞。以上结果均说明ErbB信号通路突变上调MDK，促进免疫抑制巨噬细胞的分化而招募Treg细胞到肿瘤微环境，导致免疫逃逸和肿瘤进展。

总结

本文利用单细胞测序获得了胆囊癌的肿瘤微环境图谱，利用外显子测序结果设置case组和control组，获得了单细胞测序结果比较分析的策略。比较分析涵盖细胞数目统计、基因表达、信号通路、拟时序和细胞通讯等所有的单细胞测序分析结果。此外，对单细胞测序结果进行RNAseq、免疫组化和免疫荧光的验证，获得了更强的数据支持。通过单细胞测序聚焦到MDK-LRP1这对受体和配体，通过这对基因在case和control表达情况差异以及两者对应的细胞数目、基因表达等的差异，推测MDK-LRP1参与免疫抑制M2巨噬细胞的分化及对Treg的招募和激活。通过组学分析获得的结论，通过传统分子生物学实验进行验证，获得了更强有力的数据支持。

这种大规模 GBC 转录组数据构建了一个宝贵的资源，揭示了个体肿瘤细胞和免疫细胞的遗传特性发生变化，这些细胞和免疫细胞协同驱动肿瘤恶性转化。

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