你是否一度认为：色谱柱的流向不能改变、用纯水冲洗色谱柱才能把缓冲液冲洗干净、保存在乙腈或甲醇中的新色谱柱可以直接使用、色谱柱应该保存在纯乙腈或甲醇中。。。。。。这些惯性思维是对是错？

色谱柱污染会对谱图有何影响？如何清洗污染的柱子？为何离不开异丙醇?通常解决色谱柱被污染的最佳方法是什么？柱子柱效降低了，如何进行清洗和再生？

色谱柱可以说是色谱系统的心脏。重要性可见一斑，色谱问题总是五花八门，哪些故障与色谱柱有关，哪些无关，都要我们用经验来判断。没经验？不要紧，接下来就有了！

色谱柱清洗？再生？

色谱柱在使用过程中可能因受到来自于样品或流动相的污染而导致的柱效下降或柱压升高，这时可以通过冲洗来再生色谱柱。

清洗色谱柱原则上需要使用比流动相更强的溶剂，每种溶剂至少应使用10个柱体积。色谱柱的类型不同，其清洗再生的步骤也不尽相同。

反相硅胶柱的冲洗步骤

1. 先用不含缓冲液盐的流动相冲洗（水/有机相）

2. 然后用 100% 有机相（甲醇和乙腈）冲洗

3. 75% 乙腈 / 25% 异丙醇

4. 100% 异丙醇

5. 检查色谱柱是否有恢复；如果没有，丢弃色谱柱或考虑下面操作

6. 100% 二氯甲烷 *

7. 100% 己烷*

反相聚合物柱的冲洗步骤

当使用聚合物类反相柱时，我们强烈建议流动相中最少含有 1% 的有机改性剂。长期使用100%水相洗脱液后再使用有机流动相时可能影响柱效；同时也不能用100%的水相缓冲液“冲洗”色谱柱。可以进行反向冲洗，如果起始压力高，可降低流速。

1.使用当前流动相运行清洗梯度，再用高比例有机溶剂（95%）清洗数个柱体积。重复2到3次。由于缓冲液可能在高有机相中发生析出，因此如果您的流动相含缓冲液，有机相比例不要超过70%，或者在清洗之前用不含缓冲液的流动相将缓冲液清洗掉。

2.尝试使用较高强度的有机改性剂，如 TFA，去除发生疏水键合的污染物。

3.有时用含1.0%TFA的水/乙腈（v/v）可以去除多肽或蛋白污染物。

4.用强酸和强碱（包括1 M 氢氧化钠）适当清洗而不会发生热降解。

正相硅胶柱的的反冲或清洗步骤：

对于正相色谱柱只能使用有机溶剂，如果您的色谱柱是传统的分析型 4.6 x 250 mm 色谱柱，那么每种溶剂至少需要用50 mL（相当于20个柱体积）。尝试下列强度递增的溶剂进行清洗：

1.50%甲醇∶50%氯仿

2.100%乙酸乙酯

色谱柱清洗和再生后的注意事项：

a. 切换到更强溶剂（如二氯甲烷和正己烷）或切换回原流动相时需注意前后溶剂的兼容性，必要时以异丙醇进行过度，以免发生溶剂不互溶的问题。

b. 缓冲液盐可能发生沉淀并造成色谱柱内反压。发生这种情况时，应用热水缓慢通入色谱柱，以去除沉淀。

c. 为避免沉淀，如果系统中不含非挥发性缓冲液，在纯有机溶剂进入系统之前，首先用不含缓冲液的水相流动相进行冲洗。

d. 含丙醇的冲洗溶液因粘度增大将产生更高的操作压力。在清洗过程中需要降低流速，以保持安全的操作压力。

e. 系统压过高有时不一定是色谱柱阻塞，而是系统流路某部位（如泵中的过滤白头、进样针、针座、柱温箱中的毛细管路、液相保护柱或在线过滤器等）堵塞了。因此，遇到压力高问题时应首先检查堵塞位置，然后再对症下药。

f. 不要试图更换色谱柱的进样口筛板。因为现在填充色谱柱采用的是高效工艺，这样做可能为色谱柱带来不可恢复的损坏。

g. 对于填料颗粒度小于1.8μm的色谱柱，请勿反冲色谱柱

经典Q&A实例分析

1.现在用的气相色谱仪的FID检测器噪声较大，怎么确定噪声大是否由色谱柱污染造成的呢？

听别人说通过降柱温能看出来，降低柱温，看看基线波动程度是否减弱。

取下色谱柱，封闭检测器，也可以诊断的。进样口、检测器的温度升高，柱箱温度降低，看基线信号，如果降低，就是色谱柱的问题了！

还可以用丙酮或甲醇冲洗柱子试一下，看出现的杂峰是否很多，多冲上几遍，如果一直是这样，那就应该不是柱子的事了

2.之前做的实验一直都好好的，如图1所示，就在有一天早上做也是和1一样好好的，后来不知道怎么就出现拖尾了，如图2所示，再后来就出现肩峰如图3所示，这到底是柱子被污染了,还是坍塌了？？？那应该怎么做（我用甲醇，PH=2.9的醋酸以0.5ml/min的流速都各冲洗过1小时还是没用），也不敢反冲（柱子是XBP  C18（L））。

用90%ACN（乙腈）和10%纯水冲洗过夜，次日实验不要加酸。样品溶剂纯甲醇或者纯乙腈。如若还是不行，则95%ACN饱和，两端封口，存放一周。类似问题碰到过N次了，基本都能如上解决。

或者可以反着冲洗下使用，一般柱子入口污染了，都可以这样解决，或者把柱筛板拆下来清洗下。

3.用C18液相色谱柱分离苯乙酮和1-苯乙醇，开始用的时候出的峰都没问题，进浓度稍高（0.77mg／mL）的样后峰形开始拖尾，这过程中还试了内标物苯甲酸、本甲醇、甲苯。峰拖尾是里面有残留的物质没洗出来吗？如果是该怎么洗才能洗出来呢？

峰拖尾不一定是柱子不干净，有可能是你的色谱条件不合适或者色谱柱不合适。还有你进的浓度是否太大了，把浓度降低看是否还有拖尾。然后再决定下一步操作。

新买的柱子的话，你就用甲醇水，混合溶液，也就是你洗柱子的方法，洗个一两天，最好走样品时，加预柱，刚买的新柱子，一开始使用时，峰拖尾，峰形不好看，洗了一两天柱子后就差不多了。

如果确定是有残留物没有洗脱，可以用异丙醇洗柱子，但异丙醇粘度大，单独用它洗柱子，柱压会很高，建议用异丙醇醇，水，乙腈，0.1％甲酸水和25％混合溶液洗柱子；或者先用异丙醇洗，再甲醇洗，再甲醇和水一比一洗，再蒸馏水洗。

C18 柱本身可以用二氯甲烷洗，但必须用纯的异丙醇低速平衡很久以后。如果没有平衡好，还有残留的水相，就会出现分相，柱子就真的毁了。如果可以的话，最好加个预柱。

4.液相色谱柱或者保护柱被污染，出现肩峰，怎么样把污染物清除掉，按照平时的清洗可不可以？

建议保护柱和色谱柱分别处理。如果是保护柱污染，你冲来冲去不是冲到色谱柱里了？最好用梯度洗。柱压注意不要太大，否则容易把柱子冲塌。正相应小极性到大极性，反相反过来。最后平衡一下。如果还不行的话，把柱头填料挖掉1-2cm，放新填料填紧，然后再冲。

5.为何色谱柱清洗离不开异丙醇？

首先，异丙醇特殊的溶解性，异丙醇能和乙酸、丙酮、乙腈、苯、丁醇、四氯化碳、氯仿、环己烷、二氯甲烷、DMF、DMSO、乙酸乙酯、乙醇、二乙醚、正己烷、甲醇、THF、甲苯、水、二甲苯等液相可能用到的几乎所有的溶剂混溶。混溶比例，不深究。   其次，使用流动相时，若溶剂的混溶性不好甚至不混溶，会形成乳化的小液滴，毁坏色谱柱。  

由此可得知，异丙醇具有某些特点：“去污能力”强；不伤色谱柱。以它作为过渡溶剂和清洗受污染的色谱柱及液相配件，情理之中了。 注：异丙醇粘度大，会使压力上升。

你眼中的色谱柱是不是这样的？

色谱柱的流向不能改变

在我们常规思维中，色谱柱上标示的流向是不可改变的，每次使用都要遵循。可是，大家有没有想过这个方向的作用是什么呢？为什么要标示一个使用方向呢？

其实色谱柱前后端的填料及填装工艺都是一样的，标示方向的目的就是让我们在使用中记住流动相从哪个方向流入色谱柱，那么这个流入段就是最先污染端。这样就为我们日后维护或再生色谱柱做了准备，而我们需要遵循这个规定应该在色谱柱开始做样后。

我曾将已经污染过的色谱柱反方向来使用，如果保留时间不是很长，而色谱柱足够长，还是能使用一段时间的。

不去看说明书，直接就上机使用

色谱柱内部保存着什么溶剂一定要看清楚，因此色谱柱的说明书一定要看清楚，当然也包括说明书上建议的维护保养规定，对我们都非常的有用。对于反相柱来说，溶剂基本就是乙腈或甲醇。但正相柱就不同了，因为正相柱除了可以适用正相系统，也可以适用反相系统，因此一定要看清楚，对于你的方法来说是否需要置换色谱柱内部保存溶剂。

用纯水冲洗色谱柱才能把缓冲液冲洗干净

使用强溶剂冲洗色谱柱对内部填料的损伤是最大的，尤其是纯水，除非你的色谱柱是耐水的。冲洗色谱柱最好的方法是用流动相比例的水系和有机系来冲洗。如果你认为流动相比例无法把色谱柱冲洗干净或者此比例中有机系占有比例过大，你可以使用内含10%左右的纯水来冲洗。

保存在乙腈或甲醇中的新色谱柱可以直接使用

理论上液相色谱柱不同于气相色谱柱需要活化，但是由于液相色谱柱内部保存的有机系具有挥发性，因此在使用前还是应该用小流速的和色谱柱内部相同的溶剂冲洗一定的时间。可以是0.5ml/min，120min，但最好咨询厂家，根据色谱柱参数设定。

色谱柱应该保存在纯乙腈或甲醇中

色谱柱内部保存液具有挥发性，因此为了减少其挥发速度，可以添加5%-10%的水，这样的话可以在一定程度上减少一些有机系的挥发。如果再增加一个保险，我们可以在堵紧堵头后，再用封口膜封起来。同样道理，色谱柱一段时间不用后，也应该按照第4条，进行小流速的冲洗色谱柱。

色谱柱污染后把筛板卸下来超声清洗

对于色谱柱的污染，首当其冲的就是筛板，因此我们最常用的做法就是把柱头卸下来，把筛板拿去超声清洗。但是我们在拆卸过程中对色谱柱前端填料的损害远远大于污染照成的伤害，因为我们不是专业的。因此建议这一步能不做就不做。

自己填装色谱柱

和上条相同，这一步做法几乎可以把此色谱柱判死刑了，我们的填装工具有什么呢？就是手工的，其填装压力远远小于工厂内原始的填装压力。那么我们填装的结果会是个什么样也就很明显了。在我看来，自己填装也就是练练手，熟悉一下这个过程，要把色谱柱维修好的可能性几乎为零。

用异丙醇冲洗再生后，柱子效果更差了

这种情况我自己就遇到过，还好那根柱子本来就打算报废了，因此也没有照成多少损失。但是这是什么原因呢？其实很简单，就是在我反向冲洗前没有把管路中的污染物冲洗干净就直接接了柱子。所以说，方法是没有错的，色谱柱受污染时，我们应该先想到仪器也污染了！

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