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作者：

韩素芬

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摘要：

玉米纹枯病(Banded leaf and sheath blight, BLSB)是一种主要由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)引起的土传性真菌病害,该病害已成为制约我国玉米产区的主要病害之一,尤其在高温高湿的西南地区此病的发病症状更为严重.因此,研究玉米纹枯病的抗病机制迫在眉睫,植物microRNA的发现为玉米纹枯病抗性机制的研究提供了新思路.microRNA是一类长度约22nt的内源性单链非编码RNA分子,作为负调控因子在植物生长发育及病虫害抵御过程中发挥重要的调控功能.本研究以玉米感病自交系Ye478及抗病自交系R15为实验材料,在玉米拔节期进行接菌并设置对照组,分别在接菌后Oh,6h,12h及24h取材,对Solexa深度测序候选miRNA进行实时荧光定量检测及靶基因的半定量分析,初步探讨玉米候选miRNA在玉米纹枯病胁迫中的调控机制.主要研究结果如下: 1.本研究采用RNA加尾及引物延伸RT-PCR法,对Solexa深度测序筛选的11个差异表达的已知miRNA及4个新miRNA进行真实性验证.结果表明,这15个miRNA在抗病材料R15及感病材料Ye478中均有表达,证明这15个:niRNA在玉米组织中真实存在. 2.分别在抗病材料R15和感病材料Ye478中对候选miRNA进行荧光定量表达分析,根据表达趋势将其分为四类.第一类:在抗,感材料中上调表达的miRNA:miR395c及miR827;第二类:在抗,感材料中下调表达的miRNA:miR159a,miR172b,miR394a, miR10及miR16;第三类:在抗病材料R15中下调表达而在感病材料Ye478中上调表达的miRNA:miR160a,miR1661,miR396a,miR396c,miR14a及miR49.由于miR166a及miR393b在抗病材料R15中表达差异不明显,因此将其归为一类,两者在感病材料Ye478中的表达趋势大不相同,miR166a呈上调表达趋势而miR393b呈下调表达趋势. 3.通过WMD3软件对候选miRNA的靶基因进行在线预测,并对其功能进行整理,结果表明这11条玉米已知miRNA及4条新miRNA的靶基因大多编码调控蛋白,包括MYB,GRAS,GRF,bZIP,AP2-ERF等转录因子及ARFs,TIR,AFBs等激素应答类蛋白因子;此外,靶基因还包括一些功能蛋白,比如微管蛋白,硫酸盐转运蛋白等. 4.分别选取miRNA配对程度较高的靶基因,并在抗感材料中对候选miRNA的靶基因进行半定量RT-PCR,结合miRNA的荧光定量结果进行分析,结果表明虽然存在个别时间段靶基因与其miRNA表达不一致的情况,但总体来看各候选miRNA对其相应靶基因的作用方式均为负调控. 5.课题组前期通过深度测序筛选得到四个玉米新miRNA,通过进一步分析发现,miR10可能作为miR171家族的新成员,其通过调控靶基因GRAS参与到玉米抗病应答途径.miR49可能作为miR1432家族的新成员,在玉米抗病调控途径中的作用仍有待进一步研究. 6.通过对玉米miRNA深度测序,荧光定量分析及靶基因的半定量分析,可以推测得出植物miRNA作为一类调控因子,可能通过负调控各靶基因参与到植物转录调控途径,激素信号传导途径以及有毒有害物质外排等多种抗病途径,形成一个有机的植物抗病调控网络途径,直接或间接抵御病原菌的侵染.

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关键词：

玉米纹枯病 microRNA 抗病 荧光定量PCR 半定量PCR

学位级别：

硕士

学位年度：

2012

被引量：

2