研究背景：脑血管病是严重危害人类健康的常见病和多发病，在全球已成为第一致残和第三致死的原因。随着我国人口老龄化的加剧，脑血管病发病率正在逐年增加。在我国每年有近200万新发的卒中病人，有150多万人死于脑卒中。在脑血管病的病情进展以及治疗过程中不可避免的会发生缺血再灌注损伤，如脑梗塞后溶栓、动脉瘤手术中临时阻断等。然而，迄今为止，临床上仍缺乏切实有效的治疗脑缺血再灌注损伤的药物和措施。近年来，自噬已成为缺血再灌注损伤中研究中的热点，这为脑缺血再灌注损伤的治疗带来了新的希望。其中，Beclin-1和mTOR介导的自噬信号途径，可能是调控自噬“双刃剑”转向促进细胞存活的重要调控点。

研究目的：本研究拟通过体内、体外试验检测Beclin-1蛋白和mTOR蛋白在不同鼠脑缺血再灌注损伤模型中的表达差异，进而在体外实验中研究Beclin-1和mTOR在脑缺血再灌注损伤中的交互作用。我们希望通过研究自噬关键蛋白Beclin-1和mTOR在脑缺血再灌注损伤中的交互作用及其机制，从而找到治疗脑缺血再灌注损伤的措施，为临床治疗脑缺血再灌注损伤提供重要的理论依据和新的策略。

研究方法：1.　体内实验探究Beclin-1、p-mTOR和mTOR蛋白在不同鼠脑缺血再灌注损伤模型中的表达构建鼠全脑缺血再灌注损伤（4-VO）模型，健康成年雄性SD大鼠24只，采用随机数字表法，将其分为3组(n=8)：假手术组(control)、全脑缺血再灌注0h组、全脑缺血再灌注24h组。利用四血管阻断法构建鼠全脑缺血再灌注损伤模型，通过HE染色和大鼠行为学上判断建模情况。Western　blot分别检测Beclin-1、p-mTOR和mTOR蛋白在鼠全脑缺血再灌注损伤模型中的表达。构建鼠大脑中动脉阻塞（MCAO）模型，健康成年雄性Balb/c小鼠16只，采用随机数字表法，将其分为2组(n=8)：假手术组(control)、手术组即缺血再灌注24h组。建立小鼠右侧大脑中动脉阻塞模型，通过神经功能缺陷评分和TTC染色判断建模情况。Western　blot分别检测Beclin-1、p-mTOR和mTOR蛋白在MCAO模型中半暗带中的表达。2.　体外实验探究Beclin-1、p-mTOR和mTOR蛋白在脑缺血再灌注损伤细胞模型中的动态变化利用CoCl2建立HT22细胞化学缺血模型，实验分组如下：control组、2h组、4h组、6h组、8h组、10h组、12h组、14h组、16h组。将含终浓度为500µM的CoCl2无糖培养液培养HT22细，分别于2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h和16h收集细胞蛋白，利用Western　blot分别检测Beclin-1、p-mTOR和mTOR蛋白在HT22细胞缺血损伤不同时间点的表达差异。利用CoCl2建立HT22细胞化学缺血再灌注模型，实验分组：control组、2h组、4h组、6h组、8h组、10h组、12h组、14h组。将含终浓度为500µM的CoCl2无糖培养液培养HT22细胞16h后，弃培养液，更换含血清的完全培养，按实验分组各时间点分别收集细胞蛋白，Western　blot分别检测Beclin-1、p-mTOR和mTOR蛋白在HT22细胞再灌注损伤不同时间点的表达差异。3.　Beclin-1和mTOR在脑缺血再灌注损伤中的交互作用在HT22细胞缺血损伤模型中检测雷帕霉素对Beclin-1蛋白表达的影响，实验分组：control组、2h组、4h组、6h组、8h组、10h组、12h组、14h组、16h组。取终浓度为50nM雷帕霉素和500µM　CoCl2的细胞培养液，培养HT22细胞，按实验分组收集细胞蛋白，利用Western　blot实验检测Beclin-1蛋白在各时间点的表达差异。在HT22细胞缺血再灌注损伤模型中检测雷帕霉素对Beclin-1蛋白表达的影响，实验分组：control组、2h组、4h组、6h组、8h组、10h组、12h组、14h组。按实验分组，加入终浓度为500µM的CoCl2细胞培养液，培养16h后，弃培养液，更换含50nM雷帕霉素的完全细胞培养液继续培养，按实验分组分别收集细胞蛋白，利用Western　blot实验检测Beclin-1蛋白在HT22细胞再灌注损伤后各时间点的表达差异。缺血阶段MT　T实验：取处于对　数　生长期的　HT22　细胞，按　一定的细　胞密度接　种于96　孔细胞培　养皿中，　待细胞长　至约60%~80%汇合时，　按实验分　组进行实　验。实验　分组如下　：Control组、DMSO组、50nM　Rapa组、500µM　CoCl2组、50nM　Rapa+500µM　CoCl2组。按实　验分组分　别加入相　应培养液　，培养HT22细胞10h和16h，弃培养　液，行MTT　实验。再灌注阶　段MT　T实验：　取处于对　数生　长期　的　HT22　细胞，按　一定的细　胞密度接　种于96　孔板中，　待细胞长　至约60%~80%汇合时，　按实验分　组进行实　验。分组　如下：Control组、Pre-DMSO组、Pre-50nM　Rapa组、Pre-500µM　CoCl2组、Pre-50nM　Rapa+500µM　CoCl2组。按实　验分组分　别加入相　应培养液　，培养16h时，更换　含血清的　完全培养　液，分别　于10h和14h时吸弃　培养基，　行MT　T实验。

研究结果：1.　体内实验探究Beclin-1、p-mTOR和mTOR蛋白在不同鼠脑缺血再灌注损伤模型中的表达在全脑缺血再灌注损伤模型中，Beclin-1蛋白在全脑缺血再灌注损伤后0h、24h表达均升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；p-mTOR蛋白在缺血再灌注损伤后0h、24h表达升高，在24h差异有统计学意义（P＜0.05）。在局部脑缺血再灌注损伤模型中，缺血再灌注损伤24h后Beclin-1蛋白在缺血半暗带及对侧皮层脑组织中表达均升高，且半暗带区升高更明显，差异有统计学意义（P＜0.05）；p-mTOR蛋白仅在缺血半暗带的表达增高，差异有统计学意义（P＜0.05）。2.　体外实验探究Beclin-1、p-mTOR和mTOR蛋白在脑缺血再灌注损伤细胞模型中的动态变化我们用终浓度为500µM　的CoCl2培养基培养HT22细胞模拟缺血损伤，结果发现Beclin-1蛋白在各时间点的表达随时间呈现出一定的动态变化趋势，4h即开始增高（P＜0.05），至　10h达高峰，12h后表达开始逐渐下降。mTOR蛋白在各时间点间表达无明显变化趋势，而p-mTOR表达随时间呈现出一定的动态变化趋势，10h表达开始增加，并且随着时间的延长其表达量继续升高（P＜0.05　）。在缺血再灌注损伤细胞模型中，Beclin-1蛋白在各时间点的表达均明显增高，在2h时其表达量高于对照组（P＜0.05），并且其表达量随时间延长呈现出逐渐增加的趋势。mTOR蛋白在各时间点的表达量无明显变化趋势，p-mTOR表达量较对照组相比较显著增加（P＜0.05），但无明显动态变化趋势。3.　Beclin-1和mTOR在脑缺血再灌注损伤中的交互作用在缺血阶段，给予50nM雷帕霉素处理后，Beclin-1蛋白在各时间点的表达随时间延长呈现出一定的动态变化趋势，2h时即开始增高（P＜0.05），随着时间的延长Beclin-1蛋白呈现进行性增加趋势。再灌注阶段给予50nM雷帕霉素处理后，Beclin-1蛋白在各时间点的表达随时间呈现出一定的动态变化趋势，2h时即开始增高（P＜0.05），至12h时达高峰，14h时表达量开始下降。MTT实验结果，在缺血10h和16h时雷帕霉素可加重HT22细胞缺血损伤，差异均有统计学意义（P＜0.05）。然而，再灌注损伤10h和14h时，雷帕霉素可减轻HT22细胞损伤，与对照组和缺血组相比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

研究结论：1.　在全脑缺血再灌注损伤鼠皮层脑组织和局灶性脑缺血再灌注损伤半暗带区和对侧皮层脑组织Beclin-1蛋白表达均升高。2.　终浓度为500µM的CoCl2在HT22细胞中可成功建立体外细胞化学缺血再灌注损伤细胞模型。3.　Beclin-1蛋白和p-mTOR蛋白在脑缺血期的表达存在相关性，Beclin-1蛋白主要在脑缺血损伤早期发挥调控作用，然而mTOR蛋白主要在脑缺血损伤晚期发挥调控作用。4.　雷帕霉素可诱导Beclin-1蛋白在脑缺血损伤早期表达上调，发挥脑保护性作用。5.　脑缺血损伤可诱导自噬，而脑缺血后的再灌注损伤可进一步增强自噬。Beclin-1和mTOR在脑缺血再灌注损伤过程中的不同时间点发挥的作用不同，并存在交互调控作用。