本发明属于分子检测领域，特别涉及一种检测bcor基因突变的试剂盒和检测方法。

背景技术：

bcor(bcl6co-repressor)基因位于染色体xp11.4，由15个外显子组成，编码3个同源异构体，包括3个重要的结构域：bbd、af9bd、ank1-2-3，其中bbd结构域为bcl6结合结构域，可选择性地同bcl6的poz结构域相互作用，参与转录抑制过程。bcor蛋白广泛地表达在人类的多个组织。bcor是bcl6的共抑制子，是早期胚胎发育、间充质干细胞功能和造血功能调控的关键转录调控因子。同时bcor还通过组蛋白甲基化调节染色质重塑等表观遗传学机制，参与转录抑制并影响凋亡进程。

生殖系中bcor突变与ofcd综合征有关，多为散发，x连锁显性遗传，推测为男性致死，是一种罕见的累及多器官多系统的先天发育异常性疾病，临床特征性地表现为眼部、面部、心血管和牙齿的先天发育异常，与此疾病相关的bcor基因突变绝大数为插入和缺失突变。

bcor基因还与肿瘤发生关系密切，在携带抑癌基因tp53基因突变的多种肿瘤样本中能检测到bcor基因的突变，这些疾病包括脑部髓母细胞瘤、淋巴瘤、胸腺瘤、视网膜母细胞瘤等，以上结果提示bcor可能在调节抑癌基因tp53活性方面发挥重要作用，从而参与肿瘤的发生过程。

bcor突变常见于髓系恶性肿瘤，但在淋巴系肿瘤中特异见于nktcl(nk/t细胞淋巴瘤)。dobashi等对25例nktcl的研究发现，nktcl患者中常见的体细胞突变中bcor突变占32％，这些常见的突变改变最后造成了bcor功能的丢失，进而促进了nktcl的发生。

另外，bcor和再生障碍性贫血(aa)有关，研究结果显示，aa突变最常累及的5个基因为piga、bcor/bcorl1、dnmt3a和asxl1。bcor、bcorl1和piga基因突变在aa患者中更为显著，而jak2、runx1、tet2和tp53基因突变在aa中则相对少见。并且，aa患者基因突变在位点分布上与mds/aml有高度重叠，主要表现为移码、无义和剪接突变。因此，对再生障碍性贫血的患者检测bcor基因突变，有助于了解疾病演变，而且aa高度特异性突变(如bcor、bcorl1和piga突变)通常提示对免疫抑制疗法有好的效果并预后良好，生存率高。

在2017年《成人急性髓系白血病(非急性早幼粒细胞白血病)中国诊疗指南》及欧洲白血病网中相继提出，在分子学检查初级检查之后，次级检查中指出了rna剪接染色质修饰基因突变—bcor基因突变的检测，并指出这项检查对于aml的预后判断及治疗药物选择具有一定的指导意义。

由此表明，bcor基因突变的检测对ofcd综合征的检测、再生障碍性贫血疾病进程演变及预后、aml的检测有重要的作用，尤其是在成人急性髓系白血病中的预后判断及治疗药物的选择具有重要的指导意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种检测bcor基因多态突变热点的试剂盒，采用pcr技术，可用于快速检测患者体内bcor基因多态位点的突变情况。

检测bcor基因突变的引物，其特征在于，包括扩增bcor基因的引物，其碱基序列为：

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进一步地，所述引物还包括检测bcor基因的测序引物，其碱基序列为：

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m13r：aacagctatgaccatg

进一步地，引物序列bc-e1-f和bc-e1-r是扩增bcor基因第1外显子序列的引物，引物序列bc-e2-f和bc-e2-r是扩增bcor基因第2外显子序列的引物，引物序列bc-e3-f和bc-e3-r是扩增bcor基因第3外显子序列的引物，引物序列bc-e4-(1-5)-f和bc-e4-(1-5)-r是扩增bcor基因第4外显子序列的引物，引物序列bc-e5-f和bc-e5-r是扩增bcor基因第5外显子序列的引物，引物序列bc-e6-f和bc-e6-r是扩增bcor基因第6外显子序列的引物，引物序列bc-e7-f和bc-e7-r是扩增bcor基因第7外显子序列的引物，引物序列bc-e8-f和bc-e8-r是扩增bcor基因第8外显子序列的引物，引物序列bc-e9-f和bc-e9-r是扩增bcor基因9外显子序列的引物，引物序列bc-e10-f和bc-e10-r是扩增bcor基因第10外显子序列的引物，引物序列bc-e11-f和bc-e11-r是扩增bcor基因第11外显子序列的引物，引物序列bc-e12-f和bc-e12-r是扩增bcor基因第12外显子序列的引物，引物序列bc-e13-f和bc-e13-r是扩增bcor基因第13外显子序列的引物，引物序列bc-e14-f和bc-e14-r是扩增bcor基因第14外显子序列的引物，引物序列bc-e15-(1-2)-f和bc-e15-(1-2)-r是扩增bcor基因第15外显子序列的引物。

本发明还提供了一种检测bcor基因多态热点突变情况的方法，包括以下步骤：

(1)抽提血液中的组织dna；

(2)用pcr扩增步骤1中提取的dna；其中pcr扩增引物为：

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(3)对步骤2中的扩增产物进行测序；测序引物碱基序列为：

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m13r：aacagctatgaccatg；

(4)对测序结果进行判断，确定bcor基因是否发生突变。

本发明最后提供了一种检测bcor基因多态突变位点的试剂盒，包括：

(i)血液dna抽提试剂；

(ii)检测体系pcr扩增反应液；包括扩增bcor基因的引物，其碱基序列为：

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(iii)测序体系试剂；包括检测bcor基因的测序引物，其碱基序列为：

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m13r：aacagctatgaccatg。

有益效果：本发明设计了扩增bcor全部15个外显子序列的引物。通过加接头，使所有20对引物的pcr产物均可以用一种测序引物进行测序。采用pcr技术，构建了稳定的扩增体系。通过调整引物浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳。bcor基因的突变类型种类繁多且遍布整个基因，因此本发明所述引物既能将所述bcor全外显子序列都扩增出来，也保证无论这些外显子的何处位置发生突变，都不会出现漏检的情况。相比较荧光定量pcr法降低了检测的成本和难度。荧光定量pcr法要针对不同的突变类型设计多个探针，成本高，检测难度大。

附图说明

图1为bcor基因在染色体上定位图。

图2为bcor第1号外显子野生型测序截图。

图3为bcor第2号外显子野生型测序截图。

图4为bcor第3号外显子野生型测序截图。

图5为bcor第4号外显子野生型测序截图。

图6为bcor第5号外显子野生型测序截图。

图7为bcor第6号外显子野生型测序截图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。

实施例1

检测bcor基因多态突变位点的引物，该引物的设计是针对bcor全外显子设计的扩增引物，包括：

扩增bcor基因全外显子序列的引物，其碱基序列为：

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检测bcor基因多态突变位点的试剂盒，包括：

(i)血液dna抽提试剂；

(ii)检测体系pcr反应液；

(iii)测序体系试剂；

其中，组织dna抽提试剂可购自天根dna抽提试剂盒等商品化试剂。

检测体系pcr扩增反应液包括：2×pcrbuffer；2mmdntps；kodfxdnapolymerase(1u/μl)；bcor基因15个外显子序列的上、下游引物引物bc-e1-f/r、bc-e2-f/r、bc-e3-f/r、bc-e4-(1-5)-f/r、bc-e5-f/r、bc-e6-f/r、bc-e7-f/r、bc-e8-f/r、bc-e9-f/r、bc-e10-f/r、bc-e11-f/r、bc-e12-f/r、bc-e13-f/r、bc-e14-f/r、bc-e15-(1-2)-f/r引物浓度均为10μm。

测序体系试剂包括：测序纯化液(exoi:0.6u，cip:1.2u)、edta(125mmol)、无水乙醇、75％乙醇、hidi(高度去离子甲酰胺)、测序引物：检测bcor基因全外显子序列的上、下游引物分别为m13-f(3.2μm)、m13-r(3.2μm),以及bigdyeterminatorv3.1(购买自美国appliedbiosystems公司)。

实施例2

血液/细胞/组织基因组dna抽提试剂盒(天根生物)的操作流程：

(1)抽提血液中的组织dna：1)抽取300μl血液加入900μl红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。12，000rpm离心1min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200μl缓冲液ga，振荡至彻底混匀。2)加入20μl蛋白酶k溶液，混匀。3)加入200μl缓冲液gb，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱cb3中(吸附柱放入收集管中)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱cb3放回收集管中。6)向吸附柱cb3中加入500μl缓冲液gd(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。7)向吸附柱cb3中加入700μl漂洗液pw(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。8)向吸附柱cb3中加入500μl漂洗液pw，12，000rpm离心30秒，倒掉废液。9)将吸附柱cb3放回收集管中，12，000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱cb3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。10)将吸附柱cb3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液te，室温放置2-5分钟，12，000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。

(2)试剂配置：按检测人份数配置检测体系pcr反应液各xμl，每人份19μl分装：

x＝19μl反应液×(n份标本+1份空白对照)

n为检测标本数。

(3)加样：加入检测体系pcr反应液中1μldna；空白对照加1μl生理盐水或不加任何物质。

(4)扩增：检测在常规pcr仪上进行，可用仪器包括abiveriti(美国appliedbiosystems公司)等。反应条件如下：

pcr扩增体系试剂配制方法如下：

其中，引物序列为：

(5)电泳：1.5％琼脂糖凝胶电泳，110v，25min，凝胶成像系统观察。

(6)sanger测序：

取9μlpcr产物与2μl纯化体系。按照以下程序进行纯化：

将1μl纯化产物分别与上、下测序引物按照如下体系进行混合：

反应程序：

沉淀环节：

向完成测序反应的产物中加入2μl125mmol的edta，静置5min；加入15μl无水乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心30min；倒置离心15sec，加入50μl70％乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心15min；倒置离心15sec，置于95℃金属浴上；加入10μlhi-di后进行变性试验。

变性程序结束后，上测序仪(abi3730)测序。

(7)结果判断：分别将测序结果与bcor野生型参考序列(genbank：ng_008880.1)进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。

实施例3

取5例的临床样本按实施例1和2的试剂和方法提取基因组、配制试剂、扩增和测序。每份检测体系pcr反应液中加入样本1μl。

其中一份样本的检测结果如图2、3、4、5、6、7所示：

图2显示bcor1号外显子野生型测序截图，说明1号外显子未发生突变。

图3显示bcor2号外显子野生型测序截图，说明2号外显子未发生突变。

图4显示bcor3号外显子野生型测序截图，说明3号外显子未发生突变。

图5显示bcor4号外显子野生型测序截图，说明4号外显子未发生突变。

图6显示bcor5号外显子野生型测序截图，说明5号外显子未发生突变。

图7显示bcor6号外显子野生型测序截图，说明6号外显子未发生突变。

从检测结果可以看出，本发明所述引物已经把外显子序列包括在内了，能够扩展出bcor基因全部15个外显子，并且测序结果完全准确。本发明所述引物可以准确的扩展出bcor基因全外显子，无论是野生型还是突变型。

序列表

福州艾迪康医学检验所有限公司

检测bcor基因突变的引物、试剂盒和方法

42

siposequencelisting1.0

1

42

dna

人工序列(artificialsynthesis)

1

tgtaaaacgacggccagtattatttagcacagtcctccaccc42

2

35

dna

人工序列(artificialsynthesis)

2

aacagctatgaccatgctggcgtcctctactccct35

3

39

dna

人工序列(artificialsynthesis)

3

tgtaaaacgacggccagtctcctttactgaacctcctgg39

4

37

dna

人工序列(artificialsynthesis)

4

aacagctatgaccatgcacggtggctgtgagaagttg37

5

37

dna

人工序列(artificialsynthesis)

5

tgtaaaacgacggccagtgcggagggttaaggacagt37

6

38

dna

人工序列(artificialsynthesis)

6

aacagctatgaccatggcagatatggcatcaacagaac38

7

39

dna

人工序列(artificialsynthesis)

7

tgtaaaacgacggccagtctttaaccctttgtgcttgga39

8

39

dna

人工序列(artificialsynthesis)

8

aacagctatgaccatgtcagtgaatacttatttggcgag39

9

39

dna

人工序列(artificialsynthesis)

9

tgtaaaacgacggccagtcaatccttacatggagggtgc39

10

37

dna

人工序列(artificialsynthesis)

10

aacagctatgaccatgcgtctttggtaacggtctgct37

11

39

dna

人工序列(artificialsynthesis)

11

tgtaaaacgacggccagtcggttcaagacagaaaagatg39

12

35

dna

人工序列(artificialsynthesis)

12

aacagctatgaccatgacttacagcaatgccctca35

13

39

dna

人工序列(artificialsynthesis)

13

tgtaaaacgacggccagtagttacctcccttacccagcc39

14

35

dna

人工序列(artificialsynthesis)

14

aacagctatgaccatgcagcgctctggccaacact35

15

39

dna

人工序列(artificialsynthesis)

15

tgtaaaacgacggccagtccgagaagaaccagatgctaa39

16

37

dna

人工序列(artificialsynthesis)

16

aacagctatgaccatgcttcattcaccaaatctgcgt37

17

40

dna

人工序列(artificialsynthesis)

17

tgtaaaacgacggccagttctaaatgatccattgagtgcg40

18

38

dna

人工序列(artificialsynthesis)

18

aacagctatgaccatgcacaatgaataaagacgaccag38

19

39

dna

人工序列(artificialsynthesis)

19

tgtaaaacgacggccagttggttggttttgggcactttt39

20

40

dna

人工序列(artificialsynthesis)

20

aacagctatgaccatgtttccatctccgttctctttctag40

21

36

dna

人工序列(artificialsynthesis)

21

tgtaaaacgacggccagtcgaccttcgggcttcatt36

22

33

dna

人工序列(artificialsynthesis)

22

aacagctatgaccatggccgcacatccacatct33

23

36

dna

人工序列(artificialsynthesis)

23

tgtaaaacgacggccagtccccttcccaaaagcaga36

24

34

dna

人工序列(artificialsynthesis)

24

aacagctatgaccatggaacactcaaggggtggc34

25

36

dna

人工序列(artificialsynthesis)

25

tgtaaaacgacggccagtccgcttcttctcccgtct36

26

34

dna

人工序列(artificialsynthesis)

26

aacagctatgaccatggttcgcacaggccccaga34

27

38

dna

人工序列(artificialsynthesis)

27

tgtaaaacgacggccagtttagaaggacgcgggcttaa38

28

36

dna

人工序列(artificialsynthesis)

28

aacagctatgaccatgctgcctgaacacgaactgaa36

29

37

dna

人工序列(artificialsynthesis)

29

tgtaaaacgacggccagtccctcaccaagacatccac37

30

34

dna

人工序列(artificialsynthesis)

30

aacagctatgaccatgaccaccaccgcacagata34

31

36

dna

人工序列(artificialsynthesis)

31

tgtaaaacgacggccagtccagctttgcctgttgct36

32

34

dna

人工序列(artificialsynthesis)

32

aacagctatgaccatgtcaaacactcggctgctc34

33

38

dna

人工序列(artificialsynthesis)

33

tgtaaaacgacggccagttatttttctctccctccaga38

34

36

dna

人工序列(artificialsynthesis)

34

aacagctatgaccatgcacccataccagacagaaat36

35

39

dna

人工序列(artificialsynthesis)

35

tgtaaaacgacggccagttggtatgggtgagggaaagtg39

36

37

dna

人工序列(artificialsynthesis)

36

aacagctatgaccatgtgtgaggttcgtggacagtta37

37

37

dna

人工序列(artificialsynthesis)

37

tgtaaaacgacggccagtttgggcgcacttttcattt37

38

37

dna

人工序列(artificialsynthesis)

38

aacagctatgaccatgcgtatcccaaagcatgtgtgc37

39

39

dna

人工序列(artificialsynthesis)

39

tgtaaaacgacggccagttccagtcagaaggacttagaa39

40

37

dna

人工序列(artificialsynthesis)

40

aacagctatgaccatggaagaatcagggacaacaata37

41

18

dna

人工序列(artificialsynthesis)

41

tgtaaaacgacggccagt18

42

16

dna

人工序列(artificialsynthesis)

42

aacagctatgaccatg16