弥漫性大B细胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma, DLBCL）是成人NHL中发病最常见的类型，在细胞起源、形态学特征、免疫组织化学表型、细胞分子遗传学、淋巴结内外发病情况、对化疗的反应及生存率等方面都表现出明显的异质性。随着分子病理诊断技术发展及，淋巴瘤的诊断已从单纯的组织病理进化到分子病理诊断阶段，并对许多传统意义上的病理类型更精准地分出几种独立病理亚型。新的分子病理分型从基因和分子层面对DLBCL进行了更深入的认识，使预后的判断更为准确，有利于临床筛选更精准的靶向治疗。

在细胞克隆演变过程中，基因变异不断积累，产生了特异性表达肿瘤生物学的基因表达谱。基因表达谱技术（GEP）可以帮助研究人员更准确地判定细胞来源，通过分析B细胞分化不同阶段或者共同表达的特定转录标志物进行分型。2000年在《Nature》杂志发表的一项研究中，借助表达谱芯片技术以及机器学习算法，人们首次以细胞起源（COO）在DLBCL中鉴定出两种表达模式不同的分子亚型，并命名为生发中心B细胞样（GCB）亚型及活化B细胞样（ABC）亚型，两种分子亚型大约占DLBCL总例数的80%，以及未能确定细胞来源的第三型。GCB和ABC亚型在染色体突变，信号通路的激活以及临床预后方面存在差异，在后利妥昔单抗时代的后续多项研究中均证实识别DLBCL的GCB与ABC亚型的分类体系（COO分型）在以R-CHOP方案为主的治疗中具有显著不同的预后，体现出DLBCL分子分型的重要临床意义。

分析疾病基因表达谱的常用方法是从冷冻组织中提取RNA做微阵列分析，然而因其价格昂贵，并不是每位患者都可以承担。于是，免疫组织化学技术得以广泛应用。2004年，Hans等人基于病理切片免疫组化技术，实现了通过判读 CD10、BCL-6、MUM-1 等组化标记的表达对 DLBCL 的分类，使得COO分型可以在实验室日常工作中实现，并让更多的临床患者获益。Hans分型将DLBCL分为生发中心B细胞样（GCB）亚型和非生发中心B细胞样（non-GCB）亚型。但缺陷是对同一样本人群分类准确率只有88%，仍有一部分患者不能确定细胞起源。

图1 DLBCL的免疫组化“Hans分型”法及其预后

一项来自法国和加拿大的研究，采用新的免疫组织化学模型对DLBCL进行分型。对1 843例患者采用CD10、MUM1、FOXP1和IGM进行COO分型，将DLBCL分为4个组：（1）CD10+且≥1个ABC标记阴性分为GCB型；（2）CD10-且≥2个ABC标记阴性分为GCB型；（3）CD10-且≥2个ABC标记阳性分为ABC型；（4）其余组合为未分类型。此分型方法与基因表达谱芯片的分型吻合率高达93%，而相对于GEP法更为简便易行。

2014年诞生的NanoString技术可通过20个基因mRNA表达（Lymph2CX）对98%的DLBCL患者进行COO分型，极大地提高了DLBCL分型的准确率。2020年复旦大学李小秋教授团队对上千例DLBCL肿瘤样本的基因表达谱数据进行分析，从中筛选出32个与DLBCL-COO分型显著相关的特征基因，并基于荧光定量PCR平台开发出一款适用于临床开展的基因检测产品（DLBCL-COO Assay），DLBCL-COO Assay分型结果与金标准全基因组表达谱比较一致性达到92%。

图2 基于NanoString平台COO分型及其“CHOP时代”下的预后意义

COO 分类模型发现 NF-kB 通路激活是 ABC 亚型的特征，但是针对该信号通路的药物的反应率却很少超过 40%，这表示除了 NF-kB 信号通路的激活外，淋巴瘤细胞还依赖其他作用机制。

采用常规染色体检测及荧光原位杂交（FISH）技术检测，发现在DLBCL中，一些患者有myc和bcl-2基因重排或bcl-6基因重排，被称为双打击大B细胞淋巴瘤（DHL）。还有少部分患者同时伴myc、bcl-2和bcl-6基因重排，被称为三打击淋巴瘤（THL）。DHL及THL患者约占DLBCL的5%，且常为GCB亚型，这些亚型好发于老年人，预后相对较差，对常规治疗方案不敏感。2016年更新的世界卫生组织（WHO）淋巴瘤分类标准已将DHL及THL纳入了一新的类别高级别B细胞淋巴瘤。目前已将这两种类型归为高级别B细胞淋巴瘤。还有文献报道，部分大B细胞淋巴瘤患者可能出现myc、bcl-2和bcl-6基因中的2个基因多拷贝现象，其预后也较差。

虽然人们发现当时已知的若干核型异常如MYC 易位、BCL2 易位多见于GCB亚型，但由于技术方面的限制，人们并不清楚隐藏在分子分型背后更多的遗传学意义。高通量测序技术的发展加快了人们认知 DLBCL 发病机制的脚步，KMT2D、EZH2、MYD88、CD79B、B2M 等涉及表观遗传学、细胞信号转导、肿瘤免疫逃避等众多通路的重现性基因异常发现的研究相继发表在国际重磅期刊。

2018年Schmitz等发表在《新英格兰医学杂志》的一项研究显示，通过多方法学平台手段，对574例DLBCL样本进行外显子、转录组分析、拷贝数变异分析及靶向372基因的扩增子测序分析，可将一半DLBCL分类为MCD（CD79B和MYD88L265P的伴随突变）、EZB（EZH2突变和bcl-2易位）、BN2（bcl-6融合基因和NOTCH2基因突变）、N1（NOTCH1基因突变）四种分子亚型。

图3 新分类方案中，原来三分类方案病例的分布比例

图4 原来三分类方案中，新分类方案病例的分布比例

图5 四型分类的预后

这些亚型有不同的基因表达特征及对免疫化学治疗的反应，其中BN2亚型和EZB亚型的生存情况较好，MCD亚型和N1亚型的预后较差。文章发表后，被相关领域内的专家点评为具有“里程碑式的意义”，也正式揭开了DLBCL在基因水平上的分类研究的浪潮。

研究人员发现，四种基因分型在DLBCL过去两种分类中都能发现。研究负责人路易斯·施托德解释说，肿瘤可能既属于预后较差的“活化Ｂ细胞样型”，同时又拥有BN2基因分型，而后者的预后较好。这一分类解释了三分类时某一分类内患者的预后的差异，以及对R-CHOP治疗效果差异的原因。这一分子分类将在DLBCL患者的预后预测、治疗方案筛选方面发挥重要作用，并指引未来的研究方向。

同年5月，《Nature Medicine》杂志发表了Chapuy等关于DLBCL分子亚型的研究。研究人员对304例DLBCL患者整合基因组分析，定义了5个不同的DLBCL子集: 具有外滤泡、可能边缘区起源、预后好的ABC-DLBCL（C1）；具有TP53双等位基因失活、921.3/CDKN2A缺失和相关基因组不稳定性并独立于COO（C2） ；具有BCL2 结构变异、PTEN和表观遗传学酶改变的预后不良的GCB-DLBCL（C3）；具有BCR/PI3K、JAK/STAT和BRAF通路和多个组蛋白改变的预后好的GCB-DLBCL （C4）；具有CD79B, MYD88, TBL1XR1 等突变以原发睾丸和原发中枢为代表的结外ABC-DLBCL（C5）。及无频发突变的C0型，（主要是一些富含T细胞的DLBCL）。C0、C1和C4型预后较好，C3、C5型预后差，C2型介于中间，因有TP53突变、也相对较差。不同基因突变型证明了GCB和ABC亚型的异质性，也为同为GCB亚型的C3、C4型及同为ABC型的C1、C5型之间预后的显著差异进行了很好的诠释。新特征亚群的遗传特征、突变特征和已识别改变的时间顺序为DLBCL的发病机制提供了新的见解。遗传特征独立于临床国际预后评分系统（IPI），提出新的可能的联合治疗策略。

图6 各亚群的预后：C0(灰), C1 (紫), C2 (蓝), C3 (橙), C4 (青),C5 (红)

以上两项研究鉴定出的分子亚型具有相似的基因特征，也存在一定的差异。基于此，2020年5月《Blood》杂志发表了Stuart E.Lacy 的一项928例DLBCL的基因突变聚类研究，并与前期的两项研究结果进行了汇总比较，如下表所示。研究中将DLBCL聚类分为了MYD88、BCL2、TET2/SGK1、SOCS1/SGK1和NOTCH2及NEC6个亚型。归类为MYD88亚型的患者预后较差，5年总体生存率42%；而归类为SOCS1/SGK1、BCL2和TET2/SGK1亚型的患者预后相对较好，5年总体生存率分别为64.9%、62.5%和60.1%。NEC和NOTCH2亚型预后中等，5年总体生存率分别为53.6%和48.1%。

这些研究结果再次表明，根据不同的分子生物学特征区分DLBCL不同亚型，具有潜在的指导预后分层的作用，并且显示出DLBCL的分子分型具有进一步完善的空间。

表1 与Chapuy和Schmitz的汇总比较

Wright等在Schmitz研究的基础上，新增了A53（对应于C2）和ST2（以SGK1和TET2突变为特征、GCB表型为主的肿瘤）两个亚型。为体现双打击淋巴瘤基因表达印记特征，根据MYC基因有无异常将EZB进一步分为EZB-MYC+和EZB-MYC-两个亚型。基于这七个亚型，作者还提出了DLBCL基因亚型的概率分类工具（LymphGen算法），发现63.1%的肿瘤可以明确其基因亚型。新的分子分型从基因和分子层面对DLBCL进行了更深入的认识，使预后的判断更为准确和具体化，有利于临床筛选更精准的靶向治疗。这样的治疗方案可能更加精准个体化，有助于提高疗效。目前已经有一些研究提示了这些治疗方法的较好疗效，但仍需要开展大规模的随机对照临床研究，寻找最佳的方案组合。

图7 DLBCL的不同分子亚型及使其潜在获益的靶向药

总结：DLBCL的异质性很高，明确的诊断分型对临床诊疗非常重要。通过多基因的靶向测序分析有助于对DLBCL进行分子亚型分类，实现对患者的精准危险分层和预后评估，为个体化治疗提供科学依据，使更多的DLBCL患者在“精准医学”时代下获益。

来源 | 血液新前沿

撰文 | 大星

编辑 | 33