细胞骨架（肌动蛋白微丝；F-ACTIN）绿色荧光染色试剂盒产品说明书主要用途细胞骨架（肌动蛋白微丝；F-ACTIN）绿色荧光染色试剂是一种旨在使用异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽（phalloidin），探寻细胞骨架的丝状肌动蛋白的分布和局部定向变化状况的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。主要适用于各种活体细胞（动物、人体、植物等）的细胞骨架装配的检测。产品严格无菌，即到即用，反应敏感，操作简捷，性能稳定。技术背景肌动蛋白（actin）是42KD 的球蛋白，构成细胞骨架的微丝（microfilament）和肌肉收缩装置的细肌丝（thinfilament），以及细胞膜表面伪足（pseudopodia）和微绒毛（microvilli）。肌动蛋白存在于所有真核生物细胞中，且高度进化保留，参与各种重要细胞功能，包括细胞迁移、细胞分裂、肌肉收缩、细胞形态维护、膜转运（membrane trafficking） 等。哺乳动物具有六种异构体，分成α、β、γ三类。球状肌动蛋白（G-actin）在生理条件下，组合成长丝聚合体，转化为丝状肌动蛋白（F-actin），形成细胞骨架的微丝。肌动蛋白的聚合与解聚的动态学变化是细胞骨架装配（cytoskeleton assembly）的主要参数之一。鬼笔环肽（phalloidin）是一种由毒性菇类中分离的二环七肽（bicyclic heptapeptide）生物碱，与聚合的微丝（F-肌动蛋白）结合，因此通过异硫氰酸荧光素（FITC）标记的鬼笔环肽可以体外探测细胞F-肌动蛋白的分布和含量，据此分析细胞骨架装配的调控机制。产品内容清理液（Reagent A） 毫升固着液（Reagent B） 毫升通透液（Reagent C） 毫升封阻液（Reagent D） 毫升染色液（Reagent E） 微升复染液（Reagent F） 微升产品说明书1 份保存方式保存染色液（Reagent E）和复染液（Reagent F）在－20℃冰箱里，避免反复冻融；其余的保存在4℃冰箱里，避免光照；有效保证6 月用户自备胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液：用于细胞脱离*细胞培养液：用于中和胰蛋白酶的处理15 毫升锥形离心管：用于样品操作的容器1.5 毫升离心管：用于细胞染色的容器2（微型）台式离心机：用于样品操作荧光（共聚焦）显微镜：用于细胞荧光观察实验步骤实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂置于室温下冻融。移取xx 微升通透液（Reagent C）到1.5 毫升离心管，然后分别加入xx 微升染色液（Reagent E）和复染液（Reagent F），混匀后，标记为染色工作液，置于冰槽里，放进暗室里备用。然后进行下列操作。一、直接法1． 准备1 个细胞培养6 孔板，内置1 个细胞1 X 1 cm 大小的载玻片2． 接种待测细胞培养，直至每孔铺满率达70％3． 小心抽去细胞培养液4． 轻轻加上xx 微升清理液（Reagent A）到细胞载玻片上，覆盖样品表面5． 小心抽去清理液（Reagent A）6． 轻轻加上xx 微升固着液（Reagent B）到细胞载玻片上，覆盖样品表面7． 置于冰槽里孵育30 分钟8． 小心抽去固着液（Reagent B）9． 轻轻加上xx 微升通透液（Reagent C）到细胞载玻片上，覆盖样品表面10．小心抽去通透液（Reagent C）11．轻轻加上xx 微升封阻液（Reagent D）到细胞载玻片上，覆盖样品表面12．室温下孵育30 分钟13．小心抽去封阻液（Reagent D）14．轻轻加上xx 微升清理液（Reagent A）到细胞载玻片上，覆盖样品表面15．小心抽去清理液（Reagent A）16．重复实验步骤14 和15 一次17．小心加上xx 微升染色工作液， 覆盖样品表面18．在暗室里室温下孵育60 分钟19．小心抽去染色工作液20．轻轻加上xx 微升清理液（Reagent A）到细胞载玻片上，覆盖样品表面21．小心抽去清理液（Reagent A）22．封片23．即刻在荧光（共聚焦）显微镜下进行观察（每个视野计数200 个细胞）：激发波长488nm，散发波长530nm（F－肌动蛋白染色）或激发波长350nm，散发波长460nm（细胞核染色）――绿色荧光显示F-肌动蛋白；蓝色荧光显示细胞核为圆环或椭圆状二、间接法1． 准备1 个25cm2 细胞培养瓶的待测细胞，直至铺满率达70％（约100 万细胞数）2． 小心移出细胞培养液到15 毫升锥形离心管（收集悬浮细胞）3． 加入xx 毫升清理液（Reagent A），覆盖细胞表面34． 小心移出xx 毫升清理液（Reagent A）到15 毫升锥形离心管5． 加入1 毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满细胞表面6． 放进37℃培养箱孵育1 分种7． 轻轻手击震动培养瓶，使细胞脱落8． 加入3 毫升用户自备的*细胞培养液9． 移入到15 毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞可以由此步开始）10．放进台式离心机离心5 分钟，速度为300g11．小心抽去上清液12．加入xx 微升清理液（Reagent A），混匀13．转入到1.5 毫升离心管14．放进微型台式离心机离心5 分钟，速度为300g（或1500RPM，例如EPPENDORF 5415）15．小心抽去上清液16．加入xx 微升固着液（Reagent B），混匀17．置于冰槽里孵育30 分钟18．放进微型台式离心机离心5 分钟，速度为300g（或1500RPM，例如EPPENDORF 5415）19．小心抽去上清液20．加入xx 微升通透液（Reagent C），混匀21．放进微型台式离心机离心5 分钟，速度为300g（或1500RPM，例如EPPENDORF 5415）22．小心抽去上清液23．加入xx 微升封阻液（Reagent D），混匀24．室温下孵育30 分钟25．放进微型台式离心机离心5 分钟，速度为300g（或1500RPM，例如EPPENDORF 5415）26．小心抽去上清液27．加入xx 微升清理液（Reagent A），混匀28．放进微型台式离心机离心5 分钟，速度为300g（或1500RPM，例如EPPENDORF 5415）29．小心抽去上清液30．加入xx 微升染色工作液31．用200 微升枪头上下轻柔抽吸，混匀细胞颗粒群32．在暗室里室温下孵育60 分钟33．放进微型台式离心机离心5 分钟，速度为300g（或1500RPM，例如EPPENDORF 5415）34．小心抽去上清液35．加入xx 微升清理液（Reagent A），混匀36．放进微型台式离心机离心5 分钟，速度为300g（或1500RPM，例如EPPENDORF 5415）37．小心抽去上清液38．加入200 微升清理液（Reagent A），混匀39．即刻移取10 微升在载玻片上压片40．在荧光（共聚焦）显微镜下进行观察（每个视野计数200 个细胞）：激发波长488nm，散发波长530nm（F-肌动蛋白染色）或激发波长350nm，散发波长460nm（细胞核染色）――绿色荧光显示F-肌动蛋白；蓝色荧光显示细胞核为圆环或椭圆状射注意事项1． 本产品为10 次操作42． 在整个操作过程中须戴手套，以防污染3． 孵育时，必须避免光照4． 建议检测细胞量达106 细胞数为佳5． 用户可以根据情况，适度调整试剂用量6． 建议细胞染色完成后，即刻进行荧光分析，不宜超过1 小时7． 注意：紫杉醇（PACLITAXEL），使F-肌动蛋白含量增加，荧光增强8． 本公司提供系列细胞骨架检测试剂产品质量标准1． 本产品经鉴定性能稳定2． 本产品经鉴定荧光清晰