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作者：

姚坤

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摘要：

线粒体氧化磷酸化(OXPHOS)是细胞能量的主要来源,受损导致ATP产量降低和活性氧ROS的过量产生,进而影响细胞生长和代谢.Bcl-2定位于线粒体,可消除线粒体ROS积累;而PGC.1a(过氧化物酶体增殖活化受体γ辅助活化因子-1α)是能量调控途径中的一个关键因子,主要存在于细胞核,亦定位于线粒体.但Bcl-2与PGC.1a之间是否相互作用,及PGC-1α调控能量代谢的机制仍不清楚.因此,本研究旨在调查PGC-1α是否通过调控线粒体ATP和ROS水平继而调控细胞周期,以及与Bcl-2是否存在直接或间接关系.首先我们于小鼠胚胎成纤维CH1细胞中,通过转基因技术高表达PGC-1α, siRNA干扰方法降低PGC-1α表达,同时转染空质粒pBABE-neO作为对照组,然后使用流式细胞术检测细胞周期,ROS以及ATP水平.我们发现过表达PGC-1α具有升高ATP,降低ROS和促进细胞周期的作用.Westem Blot结果显示PGC-1α高表达时,细胞周期蛋白CyclinB1/D1含量也随之升高.随之我们分别改变ATP和ROS,检测二者是否通过影响细胞周期蛋白作用于细胞周期.结果显示用寡霉素抑制CH1PGC-1α细胞中ATP生成,CyclinD1显著下调;加入H2O2提高ROS后CyclinB 1显著下调.为检测Bcl-2与PGC-1α的相关性,我们于小鼠胚胎成纤维NIH3T3细胞中成功构建了Bcl-2稳定高表达细胞株及PB对照组,PGC-lα表达量在正常生长的Bcl-2细胞和PB对照间无差异;而采用接触抑制或血清饥饿法同步化细胞在GO期时,Bcl-2细胞中PGC-1α蛋白表达量明显高于对照组;另外,在U251细胞中干扰下调Bcl-2表达,PGC-1α表达量降低,表明Bcl-2正调控PGC-1α.U251细胞中Bcl-2与PGC-1α均内源性高表达,血清饥饿同步化过程中,随时间延长,PGC-1α表达量下调,Bcl-2表达量逐渐升高;通过siRNA干扰下调PGC-1α表达,Bcl-2表达量显著性升高.说明PGC-1α负反馈Bcl-2的表达变化.我们通过免疫共沉淀进一步检测Bcl-2与PGC-1α是否相互结合,结果显示全长PGC-1α(110kD)并不与Bcl-2结合,但在70KDa处检测到特异性条带,通过查阅文献我们猜测其为PGC-1α新型剪切体,具体物质还有待进一步研究证明.综上所述,我们发现PGC-1α调控细胞周期是通过升高ATP水平抑制CyclinD1表达,同时降低ROS水平促进CyclinB1表达而实现.并且PGC-1α可能通过一种新型剪切体与Bcl-2结合,二者共同作用于线粒体途径,决定细胞的命运.以上发现有望揭示PGC-1α调控线粒体能量代谢的途径,并与Bcl-2通过线粒体通路调控癌症相关联,继而为发现新的药物靶点,改善线粒体疾病提供可行性研究.

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关键词：

PGC-1α 线粒体 氧化磷酸化 ATP ROS 细胞周期 CyclinD1 CyclinB1 Bcl-2