本发明属于生物医学技术领域，更具体地说，本发明涉及一种基于transwell孔板上室培养细胞下室吸附分离外泌体的方法和应用。

背景技术：

外泌体于1983年首次被发现，是由细胞主动分泌到细胞外基质中，呈茶托形或一侧凹陷的生物活性磷脂双分子层小囊泡，直径在30-15nm，且携带蛋白质、脂质、核酸等物质，可反映来源细胞的生理、病理情况，在多种生物状态与疾病中发挥着重要的生理病理学功能。近些年研究表明外泌体在细胞间信息传递、抗原呈递以及蛋白质核酸物质交换等起到重要的作用。特别是外泌体参与细胞间免疫信号、血管生成、增值和分化等功能，直接影响了诸如肿瘤、神经退行性疾病等的发生，因而外泌体被视为分析生物信息特征的指纹。然而，关于外泌体生物学的作用机制等根本问题仍然未得到有效解决。因而需要深入地研究外泌体独特的生物学结构和功能，探讨这些结构相关的生物学机制。但对不同来源的外泌体进行分离提纯是阻碍外泌体研究的第一道门槛。因此对外泌体有效的提纯方法研究迫在眉睫。

目前现有的外泌体分离方法主要是依据外泌体自身所具有的物理和生物学特点，主要包括：1、基于外泌体密度不同的离心方法，如差速离心法、密度梯度离心法、超速离心法等；2、基于外泌体大小的过滤方法，如超滤法、分子排阻色谱法；3、免疫亲和抓取以及peg沉淀试剂盒等三类方法。虽然这些分离方法为研究外泌体提供了极大的方便，但是也都存在较为明显的缺点。超速离心法是目前分离外泌体最常用的方法，具有操作简单，产量适中，应用广泛等优势。超速离心法的缺点是，离心机设备成本高，耗时长，重复离心可能会损坏囊泡膜结构，并且得到的外泌体中含有大量的蛋白质污染。其次，滤膜过滤法虽然已经有产品推出，但分离的时候会产生蛋白质堵塞膜孔，外泌体破裂等一系列问题。分子排阻色谱法则需要专门的仪器，并且极其耗时。免疫亲和抓取的方法虽然可以获得较高纯度的外泌体，但是使用范围小，同时成本高，产量低，也不适合广泛应用。peg沉淀法是目前成本最低，容易操作，也可用于大容量样本。但是问题也较多：例如沉淀时间较长，沉淀中杂质蛋白较多，纯度和回收率低，颗粒大小不均匀，引入的聚合物难以除去等缺点。

基于上述理由，提出本申请。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种基于transwell孔板上室培养细胞下室吸附分离外泌体的方法和应用。本发明方法可实现在细胞培养的过程中自发地分离外泌体，且分离效率高。

为了实现本发明的上述第一个目的，本发明采用的技术方案如下：

一种基于transwell孔板上室培养细胞下室吸附分离外泌体的方法，首先配制含有大量氨基正离子的水溶性聚合物溶液，灭菌后转移至transwell孔板下室；然后将具有分泌外泌体能力的细胞转移至装有完全培养基的transwell孔板上室，并在低氧条件下进行细胞培养；上室细胞孵化过程中在低氧刺激下分泌外泌体的同时由于静电作用和渗透压作用，外泌体穿过孔板被下室内聚合物牢牢抓住；细胞培养结束后，收集下室聚合物溶液进行第一低速离心处理，得到含有外泌体的聚合物溶液。

进一步地，上述技术方案还包括将所得含有外泌体的聚合物溶液依次进行去质子化、第二低速离心处理，最终收集得到纯化外泌体的步骤。

进一步地，上述技术方案，所述transwell孔板为具有上下室且通过一定孔径分隔的一类装置。本发明所述transwell孔板的孔径可不作限定，只要不影响本发明的吸附分离过程即可，例如transwell孔板可以为transwell-6板、transwell-12孔板或transwell-24孔板等中的任意一种。

进一步地，上述技术方案，所述的水溶性聚合物溶液为水溶性壳聚糖衍生物溶液、明胶溶液、氨基化透明质酸衍生物溶液、氨基化海藻酸钠衍生物溶液等中的任意一种，其中：所述壳聚糖衍生物优选为羧甲基壳聚糖；所述透明质酸衍生物可以为透明质酸、部分脱乙酰基透明质酸、透明质酸甲酯、乙酰化透明质酸等中的任意一种，优选为透明质酸；所述海藻酸钠衍生物可以为海藻酸钠、甲基丙烯化海藻酸钠等中的任意一种，优选为海藻酸钠。

进一步地，上述技术方案，所述水溶性聚合物溶液的质量百分比浓度为1～5%。

进一步地，上述技术方案，所述具有分泌外泌体能力的细胞可以为雪旺细胞、巨噬细胞、脂肪干细胞、神经干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、尿液来源干细胞、内皮祖细胞、或心脏干细胞等中的任意一种。

进一步地，上述技术方案，所述细胞在完全培养基中的接种浓度为0.5～2.0×105/ml。

进一步地，上述技术方案，所述第一低速离心处理和第二低速离心处理的条件均为：离心转速500～1500rpm，离心时间5～10min。所述第一低速离心处理的目的是为了去除混入transwell孔板下室聚合物溶液中的小粒径杂质（如坏死细胞膜）；所述第二低速离心处理的目的是为了将外泌体与聚合物溶液分离从而获得纯外泌体，达到分离外泌体的目的。

进一步地，上述技术方案，所述基于transwell孔板上室培养细胞下室吸附分离外泌体的方法具体包括如下步骤：

（1）将基础培养基和血清按照5～15：1的体积比混合后加入0.5～2%的双抗，混匀，获得完全培养基，加入到transwell孔板上室，备用；

（2）将水溶性聚合物溶解到去离子水中配制成质量百分比浓度为1～5%的聚合物溶液，然后降低所述聚合物溶液的ph值至2～6，使聚合物分子的氨基质子化，获得含有大量氨基正离子的水溶性聚合物溶液，转移至transwell孔板下室，待用；

（3）将具有分泌外泌体能力的细胞以0.5～2.0×105/ml的接种浓度转移到装有完全培养基的transwell孔板上室，再将transwell孔板放入细胞培养箱中进行低氧培养，细胞孵化过程中在低氧刺激下在transwell孔板上室产生外泌体，下室自发地由静电、渗透压作用收集外泌体；

（4）细胞培养结束后，将上室去掉后收集下室溶液，在500～1500rpm条件下离心处理5～10min去除混入的杂质，得到含有外泌体的聚合物溶液，达到提取外泌体的目的；再通过调节所得含有外泌体的聚合物溶液的ph值至11～13进行去质子化处理，最后将聚合物溶液在500～1500rpm条件下继续离心处理5～10min，收集得到纯化外泌体。

更进一步地，上述技术方案，步骤（2）所述降低聚合物溶液的ph值具体采用在聚合物溶液中加入质子释放剂、酸性溶剂或在酸性气氛的处理方法中的一种或两种以上。

更进一步地，上述技术方案，步骤（4）所述去质子化处理具体是在聚合物溶液中滴加碱液，所述碱液为氢氧化钠，氢氧化钾或氢氧化锂溶液的任一种或几种。

本发明方法的原理如下：

本发明利用含氨基的水溶性聚合物溶液，通过调节ph对聚合物分子的氨基进行质子化处理。总的来说是利用transwell孔板的独特结构，下室填装水溶性聚合物溶液，上室填装指定细胞培养液。下室中的聚合物是水溶性的，以一定浓度溶解于去离子水中，高分子链伸展且带有质子化的氨基。上室中的细胞在低氧刺激下分泌大量表面带负电的外泌体。在重力、渗透压和静电作用下，体积较小的外泌体扩散穿过孔板至下室，被聚合物牢牢“抓住”，从而实现对外泌体的分离提取。然后对下室的进行进一步的处理，可以去除其他杂质。

本发明的第二目的在于提供上述所述方法分离得到的纯化外泌体的应用，可应用于制备外泌体水凝胶。

一种温度响应型外泌体水凝胶，包含本发明上述所述方法分离得到的纯化外泌体。

一种光敏型外泌体水凝胶，包含本发明上述所述方法分离得到的纯化外泌体。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

（1）本发明方法可以在细胞培养的过程中自发的将外泌体从培养液中抓取分离出来，过程简易。同时无需昂贵的设备，成本低，操作简易。

（2）本发明方法在分离外泌体的同时，由于聚合物溶液的氨基在静电作用下牢牢的将外泌体“抓住”，保证了外泌体的形态完整，提高了外泌体分离的质量和纯度，分离效率高。

（3）本发明方法所用到的聚合物溶液或母细胞可以根据需要进行替换，应用范围更加广泛。

（4）本发明方法允许再进一步从得到含有外泌体的聚合物溶液中分离纯化外泌体，过程简单，对后续的分子分析，如免疫痕迹实验，基因组的提取，鉴定，测定等提供条件。

（5）本发明方法所得聚合物包含外泌体溶液，可以通过材料设计为具有光敏性或者温敏性的混合溶液，在外部刺激下形成含有外泌体的水凝胶，在水凝胶载外泌体方面的应用提供了新的思路。

附图说明

图1是本发明用transwell孔板进行外泌体分离的原理示意图。

图2是本发明实施例1方法提取的外泌体的tem形貌图；其中：图中标尺为100nm。

图3是本发明实施例2方法分离得到的外泌体的特征性蛋白免疫印迹实验结果。

具体实施方式

下面结合实施案例和附图对本发明作进一步详细说明。本实施案例在以本发明技术为前提下进行实施，现给出详细的实施方式和具体的操作过程来说明本发明具有创造性，但本发明的保护范围不限于以下的实施案例。

根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。

为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。

图1是本发明用transwell孔板（小室）进行外泌体分离的原理示意图，原理如下：外泌体由上室中的细胞分泌，并从细胞间隙扩散通过孔板至下室。由于下室中液面气压的存在，上室的培养液无法压入下室；同时下室中带有氨基正离子的水溶性聚合物溶液在溶剂中成伸张状态，分子链之间也存在作用力，在渗透压的作用下也不可能扩散至上室。因此上室和下室的环境相对独立，只有外泌体在重力、渗透压和静电作用的环境下会扩散至下室，从而被分离。再将下室中的溶液用去离子水稀释，便于离心除去混入的杂质。最后调节溶液ph是氨基去质子化，释放静电作用力，再次离心处理得到较纯的外泌体。

实施例1

本实施例的一种基于transwell孔板上室培养细胞下室吸附分离外泌体的方法，包括如下步骤：

1、配制完全培养基，将dmem培养基和血清按照9：1的体积比混合，然后加入1%的青链霉素双抗，混匀，获得完全培养基，取部分所述完全培养基加入到transwell孔板上室，其余保存备用。过程中防止染菌。

2、精密称取0.3g的羧甲基壳聚糖粉末并将其灭菌，溶解于10ml的去离子水中，配制质量百分比浓度为0.3%的羧甲基壳聚糖溶液。

3、向步骤2所述羧甲基壳聚糖溶液中滴加盐酸，调节所述羧甲基壳聚糖溶液的ph值至4，使羧甲基壳聚糖分子的氨基质子化，对外显正电。过程中防止染菌。

4、将液氮中的骨髓间充质干细胞解冻后转移到含有完全培养基的培养瓶中，在温度（37°c）、co2（5%）环境下培育备用。过程中防止染菌。

5、在超净操作台内将步骤2配制的羧甲基壳聚糖溶液转移至transwell孔板下室，将培养瓶中的细胞用胰酶处理后，转移至transwell孔板上室，在温度（37°c）、co2（5%）环境下培育2天。

6、待细胞在上室中长满后取出，将下室中的聚合物溶液转移到离心管中，用离心机在1000rpm下离心5分钟，去除混入下室的杂质，得到含有外泌体的聚合物溶液。

7、利用氢氧化钠溶液调节所述含有外泌体的聚合物溶液的ph至12，使聚合物分子中的氨基去质子化，此时由于羧基的存在，溶液对外显负电，释放静电作用力，再在1000rpm下离心5分钟，去除上液，加入去离子水，得到纯化外泌体溶液。

8、将0.1％sds溶液加入到离心管，提取裂解后溶液中核酸，利用qrt-pcr法检测核酸的量，结果显示在20个循环后，荧光曲线进入对数期，表明这种分离外泌体的方法可以得到充足的外泌体核酸物质，并可以用于后续的其他实验分析。

实施例2

本实施例的一种基于transwell孔板上室培养细胞下室吸附分离外泌体的方法，包括如下步骤：

1、配制完全培养基，将dmem培养基和血清按照9:1的体积比混合，再加入1%的青链霉素双抗，配制完全培养基，取部分所述完全培养基加入到transwell孔板上室，其余保存备用。过程中防止染菌。

2、精密称取0.2g的明胶粉末在紫外下灭菌10min，溶解于10ml的去离子水中，配制质量百分比浓度为0.2%的明胶溶液。

3、向步骤2所述明胶溶液中滴加盐酸，调节所述明胶溶液的ph值至3，使明胶分子的氨基质子化，对外显正电。

4、将液氮中的神经干细胞细胞解冻后转移到含有完全培养基的培养瓶中，在温度（37°c）、co2（5%）环境下培育备用。过程中防止染菌。

5、在超净操作台内将明胶溶液转移至transwell孔板下室，将培养瓶中的细胞用胰酶处理后，转移至transwell孔板上室，在温度（37°c）、co2（5%）环境下培育2天。

6、待细胞在上室中长满后取出，将下室中的溶液转移到离心管中，用离心机在1000rpm下离心5分钟，去除混入下室的杂质，得到含有外泌体的聚合物溶液。

7、利用氢氧化钠溶液调节所述含有外泌体的聚合物溶液的ph至12，使氨基去质子化，此时由于羧基的存在，溶液对外显负电，释放静电作用力，再在1000rpm下离心5分钟，去除上液，加入去离子水，得到纯化外泌体溶液。

8、利用0.1％sds溶液对外泌体裂解后，提取蛋白质。利用考马斯亮蓝法定性对蛋白质进行分析，结果显示有蛋白质的存在。

图3是本发明实施例2方法分离得到的外泌体的特征性蛋白免疫印迹实验结果，说明本发明方法获得的外泌体，可用于蛋白质分析检测等实验。