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近日热点

美国金融机构美银美林（Bank of America Merrill Lynch）和GenomeWeb联合对NGS市场做了最新的调查。结果显示，NGS市场需求依然强劲，除了传统核心的学术和政府市场之外，NGS的市场正在进一步扩大。

编者按

《一周3问·技术篇》伴随各位近3个月，也即将进入第一季尾声，在目前已经回答的9个问题中，我们回顾了CTC、肿瘤筛查、FISH、ddPCR、ARMS-qPCR等技术平台，也有PharmGKB的使用操作，还有组织活检和液体活检的比对，以及三种液体活检的对比分析，最后一期，我们将对一代测序、二代测序以及三代测序的原理进行介绍，并对比分析优缺点及应用方向。

ddPCR和ARMS-qPCR的原理有什么差异？应用呢？

一、ARMS-qPCR原理

①qPCR的检测原理

实时荧光定量PCR是指在PCR（聚合酶链式反应）反应体系中加入荧光化学物质，通过荧光信号测定每次PCR循环后产物总量，实时监测整个PCR进程，最后通过参照标准曲线对反应体系中模板进行定量分析的方法。

关键词：SYBR Green 染料法、Taqman水解探针法、阈值、Ct值

②ARMS-qPCR法

在PCR扩增时，引物的延伸是从3’未端开始的，要求引物3’端的碱基与模板需完全配对，引物才能延伸。若引物3’端与模板不能配对，则引物的延伸被阻断，不能得到扩增产物。

基于以上事实，可利用3’端含突变碱基的引物来检测靶DNA中有无相应突变位点，此即3’特异PCR，称为扩增阻滞突变系统（amplification refractory mutation system，ARMS）。

③检测结果示例（EGFR 19del）

二、ddPCR原理

在使用ddPCR进行检测时，其引物原理等于使用ARMS法，但是在PCR扩增前，ddPCR技术是对含有核酸分子的反应体系进行微滴化处理，将其分成上万个纳升级的微滴，每个微滴不含或含有一个至数个待检核酸靶分子。

扩增后，逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例，可得出靶分子的起始拷贝数或浓度，从而达到绝对定量。

ddPCR检测结果示例：

三、ARMS-qPCR与ddPCR的差异？

ddPCR对比ARMS-qPCR的技术优势

ddPCR是真正意义上的绝对定量，无需标准曲线，下限可低至单拷贝，不再依赖ΔΔCt，计数直接而准确，并且对样本质量和扩增效率要求下降，对于抑制剂也耐受，在应用中可有效区分浓度差异微小的样品。在原理层面，高灵敏度检测突变序列通过微滴化步骤在本质上稀释了“背景”DNA，使灵敏度可达0.001%。

ARMS-qPCR与ddPCR的应用比较

名称

灵敏度

样本

应用范围

ddPCR

0.001%

外周血

或组织

ddPCR以其高灵敏度广泛用于使用外周血进行的肿瘤精准用药及用药后对于耐药的实时监控，还可以在早期进行肿瘤分子分型

ARMS-qPCR

1%

组织

通过组织中DNA的特定位点识别进行肿瘤精准用药指导

精彩预告

一周3问·肿瘤篇（本周四）

肺癌靶向用药的三大问题是什么？怎么解决？

一周3问·案例篇（本周六）

患者多次化疗，已不能承受手术，如何寻找靶向药物？

终篇预告

《一周3问·技术终篇》一代测序、二代测序以及三代测序的优缺点及应用对比？

往期回顾

1.《一周3问·技术篇》液体活检三类检测

2.《一周3问·技术篇》扩增、表达、融合

3.《一周3问·技术篇》21基因RS值计算

4.《一周3问·技术篇》化疗对ctDNA影响

5.《一周3问·技术篇》FISH与ddPCR区别

6.《一周3问·技术篇》组织活检液体活检

7.《一周3问·技术篇》肿瘤筛查除了CTC

8.《一周3问·技术篇》PharmGKB找证据

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