艰难梭菌感染诊断（T/CPMA 008 |
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附录A（资料性附录）样本的核酸检测
A.1 核酸提取 取体积约1 ml的粪便样本，试剂盒提取基因组DNA，具体流程参照产品说明书，考虑到艰难梭菌为革兰阳性菌，需溶菌酶前处理30~60 min。 A.2 艰难梭菌毒素编码基因的核酸检测 A.2.1 检测靶标：tcdB 基因 A.2.2 检测方案 A.2.2.1 普通PCR 产物大小203 bp 引物序列： NK104：GTG TAG CAA TGA AAG TCC AAG TTT ACG C NK105：CAC TTA GCT CTT TGA TTG CTG CAC CT 反应条件：95 ℃ 5 min； 95 ℃ 20 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35个循环； 延伸72 ℃ 5 min 反应体系（50 μl）： 点击查看表格 成分 体积（μl） Premix Ex TaqTM （2×） 25 NK104 （25 pmol/μl） 1 NK105 （25 pmol/μl） 1 DNA 模板 3 ddH2O 20结果判读：1.5%琼脂糖凝胶电泳，203 bp处出现条带，为阳性；否则为阴性。 A.2.2.2 实时荧光定量PCR 产物大小103 bp 引物和探针序列见表A.1 点击查看表格 表A.1tcdB基因real-time PCR扩增的引物探针序列 表A.1tcdB基因real-time PCR扩增的引物探针序列 引物 名称 序列5'-3' stcdb-f ATA TCA GAG ACT GAT GAG stcdb-r TAG CAT ATT CAG AGA ATA TTG T stcdb-p FAM-C TGG AGA ATC TAT ATT TGT AGA AAC TG-BHQ反应体系（25 μl）： 点击查看表格 成分 体积（μl） Premix Ex TaqTM （Perfect Real Time） 12.5 Forward Primer （10 μmol/ L） 2.5 Reverse Primer （10 μmol/ L） 2.5 Taqman Probe （10 μmol/ L） 2.5 DNA 模板 2.0 ddH2O 3.0反应条件：采用两步法PCR扩增标准程序：预变性95 ℃ 30 s 1个循环；PCR反应95 ℃ 3 s，50 ℃ 30 s，40个循环。 结果判读：Ct≤33为阳性，Ct>35为阴性，33 |
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