添加图片注释，不超过 140 字（可选）

图2：直接法

特点

适用于检测小分子抗原，优势：实验步骤少，检测速度快，无须使用二抗可避免交互反应，结果较准确。缺点：每种靶蛋白都需要准备能够与其特异性结合的一抗，实验灵活性低，灵敏度低。

间接法：

将已知抗原连接在固相载体上，待测抗体与抗原结合后再与酶标二抗结合，形成抗原一待测抗体-酶标二抗的复合物，复合物的形成量与待测抗体量成正比，属非竞争性反应类型。

添加图片注释，不超过 140 字（可选）

图3：间接法

特点

常用于抗体的检测，只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗体检测各种与抗原相应的抗体。优势：二抗可以加强信号，而且有多种选择能做不同的测定分析。不加酶标记的一级抗体则能保留它多的免疫反应性。缺点：可能会发生交叉反应，与直接法比，实验周期长。

夹心法：

类型：分为直接夹心和间接夹心。检测抗体是酶标抗体，则可称为直接夹心ELISA；检测抗体不带有标记，则还需要使用酶标二抗与检测抗体结合，这种称为间接夹心ELISA。

直接夹心又分为双抗体夹心和双抗原夹心。夹心ELISA实验需要用到配对抗体（捕获抗体和检测抗体），原理：将捕获抗体结合到ELISA板上，通过捕获抗体固定抗原，随后通过直接或间接ELISA的方式进行检测。在夹心ELISA实验中，最重要的是对配对抗体进行验证，确保配对抗体能同时与抗原结合，以确保实验的顺利进行。

添加图片注释，不超过 140 字（可选）

图4:夹心法

特点

常用于抗原测定，适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，不适用于测定半抗原及小分子单价抗原。优点：高灵敏、高专一性，抗原无须事先纯化。缺点：抗原一定得拥有两个以上的抗体结合部位。

竞争法：

首先将特异性抗体吸附于固相载体表面，经洗涤后分成两组：一组加酶标记抗原和被测抗原的混合液；而另一组只加酶标记抗原，再经孵育洗涤后加底物显色，这两组底物降解量之差，即为所要测定的未知抗原的量。这种方法所测定的抗原只要有一个结合部位即可。

添加图片注释，不超过 140 字（可选）

图5：竞争法

特点

常测定小分子抗原：如激素和药物之类，也可以用来检测大分子抗原物质甚至是抗体。检测大分子抗原物质时，由于空间位阻的影响，使得该检测方法没有双抗体夹心法检测大分子抗原物质灵敏度高。优势：可适用不纯的样本，快速高效。 缺点：整体的敏感性和专一性都较差。

03ELISA应用

❆生命科学研究：ELISA试剂盒可以用于检测细胞因子、激素、酶、抗体等分子的含量和活性，用于生理学、免疫学、分子生物学等研究领域。

❆常规临床诊断应用：抗原及其抗体检测,特种蛋白的检测,非肽类激素的检测,血液中药物浓度的检测 。

❆食品安全检测：检测食品中的重金属,农药残留,生物毒素等。

❆畜牧养殖中疫病：饲料中农药、霉菌毒素等有毒有害物质的残留以及畜禽产品中药物残留检测，畜禽养殖中疫病诊断。

04ELISA样本

添加图片注释，不超过 140 字（可选）

利用 ELISA 进行检测的样本类型包括：血液（血清、血浆）、组织匀浆、细胞裂解液、细胞培养上清、 尿液、粪便、肺泡灌洗液、唾液、脑脊液、胸腹水、前列腺液、精液、阴道分泌物等。常见的样本处理 方法如下，仅供参考：

一、血液样本

1.血清：

1）将收集于血清分离管的全血样本，在室温放置 2 小时或 2-8℃过夜。（这是一个让血液自然凝固的

过程，温度越低，凝集越缓慢，可根据需要添加促凝剂。）

2）1000×g 离心 20 分钟，取上清。

3）可立即检测，或分装冻存于-20℃或-80℃。

2.血浆（柠檬酸，EDTA，肝素）：

1）血浆样本需要抗凝，将全血收集到干净的含抗凝剂的试管中，轻轻混匀。

2）标本在采集后的 30 分钟内于 2-8℃ 1000×g 离心 15 分钟，取上清。

3）可立即检测，或分装冻存于-20℃或-80℃。

血清/血浆的区别与选择

血清是血液凝固后缺少纤维蛋白原的血浆，故血浆中除含有纤维蛋白原和抗凝剂外，其他成份均等同于血清。

由于血清中缺乏很多的凝血因子，但有凝血产物。如果检测凝血因子，建议选择血浆样本；

因血浆中有纤维蛋白原，如果纤维蛋白原对待检测指标有影响，建议选择血清样本；

大多数情况下二者均可以选择。

二、组织样本

组织样本一般制成组织匀浆，处理方法如下：

1.使用干净的工具解剖目标组织，尽快置于冰上，以防被蛋白酶降解。（暂时不处理的组织，置于圆底微量离心管中，浸入液氮中“速冻”，在 -80℃ 下存储样品备用）

2.用预冷的 PBS 缓冲液（0.01M，pH=7.4）洗涤组织去除残留的血液，称重后备用。若组织块较大，需先剪碎。

3.在冰上用研磨缓冲液（常用 PBS 缓冲液，但最好使用 50mM Tris+0.9%NaCL+0.1% SDS,PH 7.3。或者中等强度 RIPA 细胞裂解液，注意 RIPA 裂解液 PH 值需为 PH7.3，建议不要使用含 NP-40，Triton X-100 和高浓度 DTT 的组分，会抑制抗原抗体反应。）研磨组织匀浆（加入研磨缓冲液的体积取决于组织的重量。一般情况下，每 1 克组织碎片应使用 9ml 研磨缓冲液。另外建议在研磨缓冲液中加入一些蛋白酶抑制剂，如 1mM PMSF）。得到的匀浆液可再利用超声破碎或反复冻融进一步处理（超声破碎过程中，需冰浴降温；反复冻融法可重复 2次）。

4.将制备好的匀浆液于 5000×g 离心 5 分钟，留取上清即可检测。或分装冻存于-20℃或-80℃。

5.根据实验需要，组织匀浆样本可先定量总蛋白,以便于统计分析数据，一般调整总蛋白浓度至 1-3mg/ml。某些组织样本，如肝脏，肾脏，胰腺因含有较高浓度的内源性过氧物酶, 在样品浓度较高的情况下会和试剂盒底物反应出现假阳性。

三、细胞样本

1.细胞培养上清：

1）使用 96，24，6 孔板，（贴壁或悬浮）细胞密度达到 60-90%。

2）使用 6-10mm 培养皿，T25/T75 细胞培养瓶，（贴壁或悬浮）细胞密度达到 60-90%。

3）悬浮细胞：2-8℃，2500rpm 离心 5min，收集澄清的细胞培养上清。

4）贴壁细胞：直接收集上清液，2-8℃，2500rpm 离心 5min，收集澄清的细胞培养上清。

5）立即用于检测，或分装于-80℃冻存备用。

2.细胞裂解液:

悬浮细胞：

1）2-8℃，2500rpm 离心 5min，收集细胞。

2）加入预冷的 PBS,轻轻混匀，2-8℃，2500rpm 离心 5min，收集细胞。

3）加入 0.5-1ml 中等强度 RIPA 细胞裂解液(注意 RIPA 裂解液 PH 值需为 PH7.3，建议不要使用含NP-40，Triton X-100 和高浓度 DTT 的组分，会抑制抗原抗体反应。若无 RIPA 裂解液，可使用50mM Tris+0.9%NaCL+0.1% SDS,PH 7.3)及适量蛋白酶抑制剂（如 PMSF，工作浓度1mmol/L）,置于冰上，裂解 30min-1h。裂解过程中可用枪头吹打或间断摇动离心管，使蛋白充分裂解, 出现黏糊状是 DNA，可以使用超声波破碎 DNA。（或用超声波 3-5mm 探头，功率 150-300W, 冰上超声处理样品，工作 1-2 s，停止 30 秒， 3~5 个循环。）

4）裂解或超声破碎完成，2-8℃，10000rpm 离心 10min，上清移入 EP 管中，立即用于检测，或分装于-80℃冻存备用。

贴壁细胞：

1）吸走上清液，加入预冷的 PBS 洗三次。

2）加入 0.5-1ml RIPA 细胞裂解液及适量蛋白酶抑制剂（具体要求同悬浮细胞），用细胞刮轻轻刮下贴壁细胞。

3）细胞悬液转入离心管中，置于冰上，裂解 30min-1h，或者配合超声波破碎（同悬浮细胞）。

4）裂解或超声破碎完成，2-8℃，10000rpm 离心 10min，上清移入 EP 管中，立即用于检测，或分装于-80℃冻存备用。

05elisa实验前准备工作

添加图片注释，不超过 140 字（可选）

使用前所有试剂和样本需放置于室温，静置 15分钟。建议所有的实验样本和标准品做复孔检测。

洗涤液：从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶，属于正常现象；放置室温，轻摇混匀，待结晶完全溶解后再配制洗涤液。依据所需用量计算浓缩洗涤液使用量，可将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水稀释配置成工作浓度的洗涤液。未用完的放4°C。

显色剂：按当次试验所需要用量将显色剂A 和显色剂B 等体积混合，避光；在使用前15 分钟准备，现配现用；每孔需100 μL。

稀释用缓冲液：依据所需用量计算浓缩稀释剂使用量，可将浓缩稀释剂用蒸馏水或去离子水稀释配置成工作浓度的稀释剂。

SA-HRP：如提供的为浓缩 SA-HRP ，则需使用稀释用缓冲液（1×）稀释配置成工作浓度的1×SA-HRP,每孔需100 μL。检测抗体：将干粉离心至管底，检测抗体的重溶体积请参考瓶身标签，用稀释用缓冲液重悬至相应体积。（未用完的检测抗体溶液可保存于4°C冰箱。）

标准品：冻干标准品用稀释用缓冲液重溶，重溶体积请参考瓶身标签，按说明书制备标曲所用的稀释方式配置。

06实验操作步骤加样

添加图片注释，不超过 140 字（可选）

加一定稀释的待检样品100 μL于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。

加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(按照说明书进行稀释)100 μL。37℃孵育0.5～1小时，洗涤3次。

加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液100 μL，37℃10～30分钟。※ 加入终止液后30 分钟内，使用酶标仪测量450nm 的吸光度值，设定540nm 或 570nm 作为校正波长。如果没有使用双波长校正，结果准确度可能会受影响；

计算结果：将每个标准品和样品的校正吸光度值(OD450-OD540/OD570)、复孔读数取平均值，然后减去平均零标准品OD 值。使用计算机软件作四参数逻辑(4-PL)曲线拟合创建标准曲线。另一种方法是，可以通过绘制标准品浓度做对数与相应OD 值对数生成曲线，并通过回归分析确定最佳拟合线。这个过程可生成一个足够使用但不太精确的数据拟合。

07注意事项

1）正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。

2）实验材料的保存比较重要，一般需要注意的点如下：

※ ELISA试剂盒一般是4℃保存，如果有溶解后的标准品次日需要使用，则需要-20℃，防止降解导致结果不准；

※ 未使用的标准品与未用完的试剂盒一起保存，一般试剂盒拆分后建议一周内使用，由于湿度等影响，长期放置易引起产品的不稳定；

※ 对于洗涤，常规建议机洗，有些较为老款的洗板机由于时间较久，可能加液冲力较大或有固定的洗涤液，可能会导致结果异常，需慎重选择；

※ ELISA试剂盒正式实验前，建议先进行预实验，避免出现浓度超出检测限导致的结果无法使用的情况；

※ 各家试剂盒可能略有差异，使用前建议详细阅读说明书。返回搜狐，查看更多