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作者：

常文娇

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摘要：

金黄色葡萄球菌(金葡菌)是临床常见的条件致病菌,致病力强,可引起轻微的皮肤软组织感染,也可引起威胁生命的中毒性休克综合征,败血症,骨髓炎等多种疾病.金葡菌极易产生耐药性,其中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)最为常见.万古霉素是目前临床治疗MRSA感染的首选药物,也被认为是抵御革兰阳性菌感染的最后一道防线.但随着万古霉素用量的增加,近年来出现了万古霉素耐药的金葡菌.尽管目前对万古霉素完全耐药(高水平耐药)的金葡菌仍非常罕见,但越来越多的文献报道检出低水平万古霉素耐药金葡菌,包括万古霉素中介耐药金黄色葡萄球菌(VISA)和万古霉素异质性中介耐药金黄色葡萄球菌(hVISA).与万古霉素耐药金黄色葡萄球菌(VRSA)不同,hVISA/VISA没有明确的耐药基因介导,而是金葡菌在万古霉素选择压力下产生的适应性耐药,常伴有细胞壁增厚,生长缓慢,毒力减低等适应性改变.这些变化可导致万古霉素渗透障碍,细菌难以被清除,感染反复发作,增加了临床治疗的难度.生物膜是细菌抵御抗菌药物和宿主免疫攻击的胞外屏障,与金葡菌耐药和致病密切相关.hVISA/VISA生物膜形成是否也发生了改变尚存争议,本课题重点对hVISA/VISA生物膜形成能力和机制开展研究. 目的:本研究旨在明确hVISA/VISA生物膜形成能力是否发生改变.研究生物膜形成与耐药之间的相关性,探讨生物膜形成机制和分子调控机制.研究结果将有助于进一步认识hVISA/VISA的生存方式和致病特征. 方法:(1)利用含3μg/ml万古霉素的脑心浸液(BHI)琼脂平板(BHI-V3)筛选临床分离的金葡菌中万古霉素低水平耐药菌株,对两组细菌的遗传背景,生物膜形成能力进行比较.(2)随机选择一株可以在BHI-V3平板上生长的万古霉素低水平耐药菌株0534用万古霉素进行体外诱导,使其MIC值逐步升高,获得系列万古霉素梯度耐药的菌株.用微孔成膜法及激光共聚焦显微镜检测菌株的生物膜形成能力.(3)应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测0534及其系列诱导菌株的生物膜形成调控相关基因(icaA,icaR,fnbA,SarA,agr,atlA和lrgAB)及耐药调控二元信号系统VraSR转录水平.(4)使用免疫斑点印记法测定细菌的胞外多糖粘附素(PIA)产生能力.(5)利用凝胶迁移阻滞实验(EMSA)检测与金黄色葡萄球菌生物膜形成基因(icaA,icaR和fnbA)及调控基因(Agr,atlA和SarA)启动子区域的结合情况.DNase I足迹印记实验鉴定VraR蛋白与靶基因启动子区的结合位点. 结果:(1)本研究共收集临床分离的金葡菌176株.其中16株金葡菌可在BHI-V3筛选平板上生长,命名为 GV3.经鉴定这16株菌株均为MRSA.故我们随机挑选16株不在BHI-V3筛选平板上生长的MRSA菌株作为对照组,命名为NGV3组.两组菌株遗传背景基本一致,多为 agr II,SCCmec III,t030型.微孔成膜法检测显示,所有GV3菌株均可形成明显的紫色斑状固着物,而NGV3组仅有部分菌株可形成一层薄薄的紫色固着物.结晶紫染色半定量分析显示,GV3组菌株平均吸光度值明显高于NGV3组(0.336±0.088 Vs0.109±0.036). (2)0534菌株经过万古霉素体外传代诱导后,可获得系列不同万古霉素耐药水平的菌株,最高万古霉素MIC值可达32μg/ml.与原代菌株相比,系列万古霉素梯度耐药菌株均可形成紫色斑状固着物,并且随着万古霉素MIC值的升高,颜色逐渐加深.结晶紫染色半定量分析显示,诱导菌株0534-V8(1.74±0.10),0534-V16(2.23±0.07)和0534-V32(2.85±0.05)平均吸光度值明显高于原代菌株0534(0.41±0.03).激光共聚焦显微镜观察菌株生物膜三维立体结构,发现较之原代菌株0534,系列万古霉素梯度耐药菌株均形成了紧凑的,厚的生物膜.其中,0534-V32菌株生物膜平均厚度为12±0.7μm,远大于0534菌株生物膜平均厚度(2±0.4μm). (3)qRT-PCR检测结果显示,与NGV3组菌株相比,GV3菌株 icaA和 fnbA转录水平分别增高了1.67倍和3.44倍.而icaR和agr转录水平下降了1.88倍和2.18倍.与原代菌株相比,系列万古霉素梯度耐药诱导株 icaA,fnbA,atlA和 sarA转录水平均明显上升,而icaR,agr转录水平明显下降.且基因表达水平的变化与菌株万古霉素MIC升高的程度密切相关. (4)相较之于原代菌株,系列万古霉素耐药诱导株的PIA表达均明显增高.其中0534-V32菌株PIA表达量是0534菌株的5.31倍.且PIA表达水平增高与菌株万古霉素MIC升高的程度密切相关. (5)与NGV3组菌株相比,GV3菌株耐药相关双组份调控系统VraSR转录水平增高了2.20倍.与原代菌株相比,系列万古霉素梯度耐药诱导株VraSR转录水平均明显上升,与促生物膜形成基因(icaA,fnbA,atlA和 sarA)表达量呈正相关,与抑制生物膜形成的icaR,agr表达量呈负相关.使用重组表达并纯化的rVraR蛋白,进行凝胶迁移阻滞实验,结果显示VraR不能与fnbA,icaADBC,sar,atlA基因的启动子区域直接结合.但可以与Agr启动子区域直接结合.DNase I足迹印记实验进一步验证表明VraR与agr启动子区的结合位点位于P2和P3启动子之间. 结论:(1)hVISA/VISA生物膜形成增加,且随着万古霉素MIC值升高,生物膜形成能力逐渐增强.(2)hVISA/VISA可通过FnbA高表达和PIA依赖途径促进生物膜形成.(3)万古霉素耐药相关二元调控子VraSR可直接结合agr启动子区域,间接调控金葡菌生物膜形成.

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关键词：

金黄色葡萄球菌 万古霉素 适应性耐药 生物膜 渗透障碍 调控机制

学位级别：

博士

学位年度：

2017

DOI：

10.7666/d.D01240034