脂肪酸合成(Fatty Acid Biosynthesis, FAS)是生命的基石, 是所有生命体不可或缺的基础代谢途径之一, 其对于磷脂合成、细胞膜组装、细胞信号转导、能量储存和基因表达调控必不可少[1-5]. FAS基于其活性中心的组成方式不同分为Ⅰ型和Ⅱ型两种基本类型: FAS-Ⅰ主要存在于哺乳动物及真菌中, 由合成脂肪酸所需的所有酶活反应结构域组成的单个多功能巨大合酶负责脂肪酸的生物合成. FAS-Ⅱ则广泛分布在细菌、植物及线粒体中, 通过一系列由单一基因编码的可溶性酶依次相互配合来完成脂肪酸合成.除此之外, FAS-Ⅱ还产生多种细胞代谢产物用于合成关键的细胞组成成分, 例如硫辛酸和群体感应分子等[2].因此, FAS-Ⅱ在细菌体内扮演着关键角色, 该途径的酶系被公认为是重要的抗病原菌药物靶标群.目前, 临床抗菌药物依然以抗生素为主流, 但病原菌的抗生素耐药性已上升到全球卫生紧急情况的水平[6-7], 结核病(Tuberculosis, TB)已成为感染性疾病死亡的主要原因[8]; 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)则已成为胃溃疡和胃癌发生的重要诱因, 且尚无特效药[9].这使得发展新型和特异性抗菌药物迫在眉睫.然而由于FAS-Ⅱ途径的分子机制研究工作进展缓慢, 发展的抑制剂存在显著的脱靶效应等原因, 目前尚未有靶向该途径的新型药物上市.本综述重点阐述了近年FAS-Ⅱ途径酶系的分子催化调控机制研究及抑制剂发现的研究进展, 为开发靶向FAS-Ⅱ酶系的新型抗菌药物提供更多思路与可能性.

根据脂肪酸合成中的催化过程, FAS-Ⅱ主要分为合成起始(Synthesis initiation)和碳链延长循环(Elongation cycle)两个阶段, 酰基载体底物蛋白(Acyl carrier protein, ACP)携带脂肪酸碳链底物在两个阶段中各个酶之间依照一定的顺序往返穿梭并进行碳链的催化和延长(图 1).

脂肪酸合成起始阶段主要由holo-ACP合酶(holo- acyl carrier protein synthase, AcpS)和丙二酰辅酶A/乙酰辅酶A-ACP转酰化酶(Malonyl-CoA: ACP transacylase, FabD)两个酶参与催化.首先, AcpS将其底物辅酶A (Coenzyme A, CoA)上的4'-磷酸泛酰巯基亚胺手臂(4'-Phosphopantetheine, 4'-Ppt)转移至酰基载体底物蛋白apo-ACP上, 从而将其活化为具有携带脂肪酸底物能力的holo-ACP.接下来FabD将其底物乙酰辅酶A (Acetyl- CoA)上的乙酰基或丙二酰辅酶A (Malonyl-CoA)上的丙二酰基转移到holo-ACP的4'-Ppt手臂末端巯基上形成共价硫酯, 从而使ACP携带了初始的脂肪酸短碳链底物.随后, 携带初始碳链底物的ACP即进一步进入碳链延长阶段进行循环的饱和(Saturated fatty acids, SFA)或不饱和脂肪酸(Unsaturated fatty acids, UFA)的碳链延长催化.

在碳链延长阶段, 饱和脂肪酸的合成主要由四类酶依次参与反应: β-酮酰基-ACP合成酶(β-Ketoacyl-ACP synthase, FabH/FabY/FabB/FabF), β-酮酰基-ACP还原酶(β-Ketoacyl-ACP reductase, FabG), β-羟酰基-ACP脱水酶(β-Hydroxyacyl-ACP dehydratases, FabA/FabZ), 以及β-烯酰基-ACP还原酶(β-Enoyl-ACP reductase, FabI/ FabK/FabL/FabV). ACP携带的初始丙酰基碳链底物首先在β-酮酰基-ACP合成酶(FabH/FabY)的催化下脱羧缩合生成β-酮酰基-ACP; 然后经过第二步NAD(P)H依赖型β-酮酰基-ACP还原酶(FabG)进一步还原为β-羟酰基- ACP; 紧接着通过第三步β-羟酰基-ACP脱水酶(FabA/FabZ)脱水生成反式(trans-2)不饱和β-烯酰基- ACP; 最后经过NADH依赖型β-烯酰基-ACP还原酶(FabI/FabK/FabL/FabV)将其还原生成饱和脂肪酸碳链.经过这四步催化后, 初始短碳链底物延长了2个碳原子.随后, ACP携带着脂肪酸底物继续与循环阶段的第一步催化酶β-酮酰基-ACP合成酶(FabB/FabF)反应, 将其底物Acetyl-CoA上的酰基转移至ACP短碳链底物顶端并缩合生成β-酮酰基-ACP, 从而进行进一步的碳链延长至16~18个碳.合成结束后, 脂肪酸碳链在硫酯酶(Thioesterase, TE)的催化下从ACP上释放出来[4-6].硫酯酶在细菌中的研究较少, 而在植物中报道较多, 因为由植物TE介导产生的中长链脂肪酸(C8~C14)是很有前途的航空煤油和汽油的前体[10].另外, 在一些能合成冗长脂肪酸链的菌株中(例如结核分枝杆菌, Mycobacterium tuberculosis, Mt), 脂肪酸可不释放而是继续进行碳链循环延长至更长的碳链长度[3].

与饱和脂肪酸合成类似, 不饱和脂肪酸的合成也经历碳链循环延长催化.但区别在于, 在不饱和脂肪酸碳链延长催化中, 经过第三步脱水反应产生的trans-2反式不饱和β-烯酰基-ACP需要经过额外的异构催化反应生成cis-3顺式不饱和脂肪酸, 再通过FabB催化进入碳链循环, 从而生成含有顺式不饱和双键的不饱和脂肪酸.相对于细菌中高度保守的饱和脂肪酸碳链循环合成, FAS-Ⅱ在不饱和脂肪酸碳链合成中实现异构催化反应的酶存在较大的菌属差异, 这可能跟菌属生存环境差异相关.由于不饱和脂肪酸是细菌维持正常膜结构和功能的必需原料, 催化该步反应且具备多样性的关键酶是发展选择性抗菌药物的优秀潜在药物靶标群, 在抗菌药物研发中具有巨大潜力.然而, 目前针对这类异构催化酶的机制研究极度滞后, 大部分相关酶尚未被发现, 分子机制更有待阐明, 药物发现尚处于空白.

ACP是FAS-Ⅱ途径中的核心蛋白, 是脂肪酸底物的携带载体蛋白. ACP负责共价携带脂肪酸链在该途径酶系中依次穿梭参与催化.同时, ACP在其他分子合成及代谢调控中也起着关键作用, 例如通过与阴离子转运蛋白(Anion Transporter protein, YchM)形成复合物来调控碳酸氢盐的转运, 进而影响脂肪酸的代谢等[11].

ACP是由约79个氨基酸构成的小型酸性蛋白.目前已解析的多个菌属ACP三级结构显示其均呈现为四个α螺旋平行堆积的α螺旋束(图 2a, 附表 1).尽管不同菌属ACP的氨基酸序列存在多样性, 但组成α2螺旋的氨基酸极度保守.因为α2螺旋不仅是ACP与FAS-Ⅱ各个酶相互作用的关键识别结构域, 位于其N端的丝氨酸更是共价连接4'-Ppt的关键活性位点(图 2a~2c)[12].它的侧链在AcpS酶催化下共价连接4'-Ppt手臂, 然后脂肪酸底物进一步共价连接至手臂顶端巯基上形成初始脂肪酸底物, 并伸入ACP四个α螺旋束中间的疏水空腔中进行底物转运.在参与酶活反应时, 脂肪酸碳链从空腔中伸出并插入酶的活性口袋中催化, 完成后再次返回ACP空腔并被ACP携带参与下一个酶活反应[2, 13].由于ACP无酶活催化功能, 目前尚无靶向ACP的抑制剂报道.

(a) ACP晶体结构示意图.其中apo-和holo-ACP来自于幽门螺旋杆菌(pdb号码: 5H9G和5H9H); Heptanoyl-ACP来自于大肠杆菌(pdb号码: 2FAD). (b) 4'-磷酸泛酰巯基亚胺手臂(4'-Ppt)的化学结构式. (c) ACP保守α2螺旋的一级序列比较图, 能被4'-Ppt修饰的保守丝氨酸用星号标出.

(a) Overall crystal structures of apo-and holo-form ACP (from Helicobacter pylori, pdb codes: 5H9G and 5H9H), and Heptanoyl-ACP (from Escherichia coli, pdb code: 2FAD). (b) Chemical structure of the 4'-Phosphopantetheine (4'-Ppt) arm attached to ACP. (c) The primary sequence comparison of ACP α2 helix among bacteria. The conserved serine that can be modified by 4'-Ppt is marked with an asterisk.

Holo-ACP合酶(AcpS)催化了脂肪酸合成途径第一阶段——合成起始阶段的第一步生化反应, 对通过基因直接表达的不具备携带脂肪酸底物能力的apo-ACP进行翻译后修饰和激活, 即通过AcpS将CoA上的4'-Ppt转移至apo-ACP保守丝氨酸侧链上生成holo-ACP[2].该催化反应分为三步(图 3a): (1) ACP丝氨酸残基的去质子化; (2)去质子化的丝氨酸对CoA上β-磷酸进行SN2型亲核反应, 生成holo-ACP并释放; (3) CoA的3', 5'-α-磷酸被AcpS质子化后将产物释放.

(a) AcpS催化机制示意图. (b) ScAcpS-CoA复合物结构示意图.与CoA(紫色)结合的关键残基以绿色/青色标示. (c) BsAcpS-holo-ACP复合物结构示意图. (d) EcAcpS-holo-ACP(蓝)、BsAcpS-holo-ACP(绿)与ScAcpS-CoA(紫)复合物结构活性口袋叠合图. (e)抑制剂Anthranilic-4(紫)与BsAcpS的活性口袋结合模式图.参与结合的残基显示为绿色, 还显示了邻氨基苯甲酸-4的化学结构.

(a) The schematic diagram of AcpS catalytic mechanism. (b) Overall crystal structure of ScAcpS-CoA complex. Key residues involved in CoA (purple) binding are shown in green/cyan sticks and labeled. (c) Overall crystal structure of BsAcpS-holo-ACP complex. (d) Superposition of CoA binding pocket among EcAcpS-holo-ACP (cyan), BsAcpS-holo-ACP (green) and ScAcpS-CoA (purple) complex structures. (e) The binding mode of the inhibitor Anthranilic-4 (purple) in the active pocket of BsAcpS. The residues involved in the binding are shown in green sticks and labeled, and the chemical structure of Anthranilic-4 is also shown.

目前有来自13个菌属的AcpS蛋白结构解析, 并展现出了三级结构的高度保守性(附表 2).以天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor, Sc) ScAcpS晶体结构为例, 其催化构象为高度对称的三聚体, 每个单体通过贡献3个β折叠形成了三聚体中央的九个β折叠桶状结构, 并在三聚体中两个单体之间通过各自贡献一半活性催化位点的方式构成了三聚体中三个对称的ScAcpS酶活中心.每个酶活中心首先结合一分子CoA及Mg2+, 并通过ScAcpS的Arg52和His110的氢键相互作用稳定CoA的3'-磷酸基团, 通过疏水相互作用稳定4'-Ppt臂(图 3b).同时, 位于4'-Ppt附近的Glu57使ACP的保守丝氨酸去质子化, 以准备对CoA的β-磷酸进行亲核攻击[14].

随后, apo-ACP结合至AcpS, 亲和攻击即被触发并完成4'-Ppt的转移.通过分析已解析的大肠杆菌(Escherichia coli, Ec) EcAcpS、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis, Bs) BsAcpS和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, Sa) SaAcpS分别与holo-ACP和apo-ACP的复合物结构发现(附表 2), 三个ACP分子分别通过其保守的α2螺旋与AcpS三聚体中三个酶活中心附近的α1螺旋形成强电荷作用相互接触(图 3c). EcAcpS-holo-ACP结构呈现了反应的中间状态, ACP的4'-Ppt臂替换了CoA占据的位置; 而BsAcpS-holo-ACP结构则呈现为反应的结束状态, holo- ACP的4'-Ppt臂已收回至ACP的疏水空腔中(图 3d).值得注意的是, holo-ACP体现出了比apo-ACP更强的AcpS亲和力, 在结构中也更靠近AcpS[15]; 同时, 第一个holo-ACP分子与AcpS三聚体的结合会造成接下去的两个holo-ACP分子的结合力降低约20倍.这提示AcpS在识别ACP底物中可能存在反馈抑制机制.因此, AcpS可能是脂肪酸生物合成的潜在监控点:调节AcpS活性可以防止不必要的CoA降解、holo-ACP的过量产生及apo-ACP(有毒代谢产物)的积累[16].

相比于细菌中AcpS三聚体聚合形式及亲水型ACP结合模式, 人源AcpS聚合形式(分子内二聚体的单个蛋白)和结合模式(疏水型ACP结合模式)显著不同.如果AcpS确实是细菌脂肪酸生物合成的监控点, 那么针对细菌AcpS开发选择性抑制剂, 理论上可在脂肪酸合成起始阶段阻断细菌脂肪酸来源, 而不会影响人类脂肪酸的生物合成[17].目前细菌AcpS的靶向抑制剂报道了两类(表 1): (1)靶向BsAcpS的邻氨基苯甲酸(Anthranilic)类化合物, 复合物结构证实该类化合物通过竞争性结合CoA结合位点来阻碍CoA结合和催化反应进行(图 3e)[18]. (2)从未知细菌中提取的靶向BsAcpS的二氮醌三环碳类化合物Sch538415, 机理尚不明确[19].

在apo-ACP被AcpS活化成holo-ACP之后, 丙二酰辅酶A/乙酰辅酶A: ACP转酰化酶FabD催化了脂肪酸合成途径第一阶段合成起始阶段的第二步生化反应. FabD通过“乒乓机制”(Ping-Pong mechanism)将丙二酰辅酶A(乙酰辅酶A)上的丙二酰基(乙酰基)催化转移至holo-ACP的4'-Ppt臂顶端巯基上, 从而在holo-ACP上装载初始的脂肪酸短链底物(图 4a).在这个反应中, FabD首先与丙二酰辅酶A(乙酰辅酶A)结合, 丙二酰基(乙酰基)部分从辅酶A上转移到FabD的催化二联体His-Ser中的Ser侧链上, 形成FabD-丙二酰(乙酰)酯复合中间体, 而辅酶A从FabD中释放出来[20].然后holo-ACP结合至FabD-丙二酰(乙酰)酯复合中间体, 其4'-Ppt臂伸入FabD活性口袋, 靠近丙二酰(乙酰)基团附近, 丙二酰(乙酰)基团即从FabD的Ser侧链上转移到4'-Ppt臂末端巯基上, 形成了Ⅱ型脂肪酸合成途径初始脂肪酸底物-丙二酰(乙酰)ACP, 并进入碳链延长循环对脂肪酸底物进行延长催化[21].

(a) FabD催化机制示意图. (b) EcFabD-丙二酰CoA(紫色)复合物晶体结构示意图.与CoA(紫色)结合的关键残基以绿色/青色标示.

(a) Schematic diagram of FabD catalytic mechanism. (b) Overall crystal structure of EcFabD in complex with malonyl-CoA (purple). Key residues involved in CoA (purple) binding are shown in green/cyan sticks and labeled.

目前来自于13类菌属的FabD结构已被解析, 其三级结构和重要功能氨基酸高度保守(附表 3)[21-22].以EcFabD晶体结构为例, EcFabD由大小两个结构域组成.其大结构域(氨基酸1~126和199~309)属于磷脂酶A2结构域超家族, 其核心为反平行的β折叠, 包含了主要参与催化的GHSVG保守五肽区域. β折叠被12个α螺旋包围, 其中5个α螺旋在蛋白质表面形成螺旋瓣.小结构域(氨基酸127~198)为铁氧化还原蛋白样(Ferredoxin-like)折叠, 由一个四链的反平行β折叠和两个α螺旋组成(图 4b)[23-24].其中, 来自大结构域的Q11、Q63和R117通过侧链的氢键和盐桥作用稳定伸入通道的CoA上的丙二酰基, 催化二联体His91-Ser92的丝氨酸则与丙二酰基部分共价连接, 而M121及其相邻氨基酸与FabD严格的底物特异性有关(图 4b)[22].而来自小结构域的P164、Q166、R190和大结构域的R287在通道入口处共同锚定了丙二酰CoA的核糖部分.

进一步对鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii, Ab) AbFabD的研究发现, 其K195、K200和R297(对应EcFabD的R287)是结合ACP的关键位点. K195A/K200A双突将完全丧失与holo-ACP的结合能力[22].此外, R297A单突导致ACP亲和力低约一个数量级.目前尚无FabD与ACP的复合物结构报道.

由于FabD是FAS-Ⅱ中唯一将脂肪酸初始底物催化加成至ACP上的酶, 对于脂肪酸合成具有不可替代的作用.因此FabD作为潜在的抗菌药物靶标受到了广泛关注.目前靶向FabD的抑制剂已有五类被报道(表 2), 但这些抑制剂的抑制机理还不完全清楚, 也没有FabD-抑制剂复合物晶体结构发表.其中, 三氟拉嗪(Trifluoperazine, TFP)对大肠杆菌和鲍氏不动杆菌的生长有显著抑制作用.分子对接结果提示TFP可能结合在AbFabD保守活性口袋中, 通过与Gln22, His100, Met141和Val206侧链形成疏水相互作用阻碍AbFabD与ACP的结合[22]. Corytuberine (COT)、胡桃醌(Juglone)和1, 4-萘醌(1, 4-naphthoquinone, NPQ)属于非竞争性抑制剂, 结合在FabD活性位点以外的潜在部位, 与底物不形成竞争关系. COT被报道可抑制幽门螺旋杆菌HpFabD酶活[25]; Juglone则同时抑制HpFabD、胱硫醚γ-合酶(Cystathionine γ-synthase, HpCGS)以及β-羟酰基- ACP脱水酶HpFabZ的酶活[26]; NPQ与Juglone结构类似, 它和阿朴吗啡生物碱(Aporphine alkaloids)[27]均可通过抑制病原体卡他莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis, Mc) McFabD酶活抑制该病原菌的生长[28].

脂肪酸延伸阶段的第一步由β-酮酰基-ACP合成酶(β-ketoacyl-ACP synthase, KAS)承担. KAS依据其功能不同主要分为KAS-Ⅰ, KAS-Ⅱ和KAS-Ⅲ三类.其中, KAS-Ⅲ (FabH)仅出现在碳链循环延长的起始步骤, 将ACP携带的丙酰基脂肪酸短链底物脱羧缩合生成β-酮酰基-ACP, 是连接脂肪酸合成起始阶段和碳链循环延长阶段的关键酶; 而KAS-Ⅰ和KAS-Ⅱ (FabB和FabF)虽然催化功能与FabH类似, 但其主要参与碳链循环过程, 将丙酰基转移至已完成第一轮碳链循环的ACP-偶数碳链底物上生成β-酮酰基-ACP, 是连接碳链循环阶段上下游的酶.另外, 最近有研究发现在铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa, Pa)中KAS-Ⅰ/Ⅱ的同源蛋白PaFabY可以承担KAS-Ⅲ的功能, 参与启动脂肪酸的延伸.

FabH主要识别来自于碳链起始阶段FabD的催化产物, 将其脱羧缩合后进入碳链延长循环阶段进行进一步碳链延长催化, 是碳链循环延长的起始步骤.研究发现, FabH利用其活性口袋中关键的Cys-Asn-His催化三联体, 对底物的催化采用“乒乓机制”: FabH的活性位点半胱氨酸首先与第一底物酰基CoA结合, 酰基转移至半胱氨酸上, CoA脱去, 形成FabH-酰基复合物中间体.随后半胱氨酸与FabD的催化产物丙二酰ACP发生缩合反应, 酰基连接至丙二酰ACP上并缩合生成β-酮酰基-ACP(图 5a).同时, FabH除了是FAS的催化酶外, 还凭借其底物专一性决定着生物体的脂肪酸分布[29-30].例如大肠杆菌中直链脂肪酸占主导地位, 乙酰辅酶A和丙酰辅酶A是FabH的首选底物[31].又如在同时产生直链脂肪酸和支链脂肪酸的枯草芽孢杆菌和天蓝链霉菌中, FabH还可以使用支链酰辅酶A作为底物[30].当FabH催化产物进入脂肪酸循环延伸后, FabH不再参与后续的催化.碳链循环过程中后续脂肪酸的缩合反应由KAS-Ⅰ和KAS-Ⅱ (FabB和FabF)催化完成. FabB和FabF催化功能与FabH类似, 但其主要识别来自碳链循环过程中的催化产物, 是参与维持碳链循环持续进行的酶.与FabH不同的是, FabH关键的Cys-Asn-His催化三联体在FabB和FabF中更改为Cys-His-His构型[2]; 同时FabB和FabF的第一催化底物也不再是酰基CoA, 而是携带有脂肪酸链的酰基ACP(图 5a).另外, FabB与FabF之间也存在不同的底物特异性. FabB可以催化FabA异构产物cis-3-癸烯酰-ACP从而参与不饱和脂肪酸合成, 而FabF则仅催化携带有饱和脂肪酸链的ACP.

(a) KAS家族反应机制示意图. (b) EcFabH晶体结构示意图, N端与C端的保守折叠以黑色字体标记, 连接及插入区域以灰色字体标记. (c) EcFabB(绿)/F(蓝)-ACP(青/黄)共价复合物晶体结构及共价机制.黑色箭头显示关键氨基酸或loop的构象变化. (d)抑制剂TLM(紫)与EcFabB结合模式图. (e)抑制剂Cerulenin(紫)与BsFabF结合模式图.

(a) Schematic diagram of KAS family catalytic mechanisms. (b) Overall crystal structure of EcFabH. The conserved N-and C-terminal folding regions are labeled with black fonts, while the connection and insertion regions are labeled with grey fonts. (c) Superposition of EcFabB (green)-ACP(cyan) and EcFabF(blue)-ACP(yellow) complex structures. Black arrow shows conformational changes of key residues or loop structure. (d) The binding model of inhibitor TLM (purple) in the active pocket of EcFabB. The residues involved in the binding are shown in green sticks and labeled. (e) The binding model of inhibitor Cerulenin (purple) in the active pocket of BsFabF.

目前, 来自于16类菌属的FabH结构已被解析(附表 4).以EcFabH的结构为例, FabH分为N-末端(1~170)和C-末端(171~317)两部分, 并由五层αβαβα结构组成其核心催化区域.其中每个“α”包含两个α螺旋, 每个“β”由五链混合的β折叠组成(图 5b).不同物种FabH的底物结合位点具有高度保守性, 而在通道的底部是活性位点氨基酸.基于晶体结构, 不同物种的FabH酶中乙酰辅酶A结合裂隙的三维形状在裂隙基部附近的差异似乎比序列比对更大, 这主要是由于活性位点裂隙底部最保守的苯丙氨酸采取了的不同旋转构象(图 5b)[32].革兰氏阳性菌和结核分枝杆菌中, MtFabH的Phe/Tyr采用的构象能量较高, 底物结合袋空间较大.另一方面, 革兰氏阴性菌例如大肠杆菌和流感嗜血杆菌(Haemo- philus influenzae, Hi)具有相同的Phe侧链(分别为Phe304和Phe303, 对应于EcFabF的F398, EcFabB的F390), 它们朝向蛋白质的疏水核心内, 且周围较大侧链残基极大地减少了底物结合袋, 使酶仅接受小的酰基CoA底物如乙酰辅酶A.随后发现的铜绿假单胞菌PaFabY虽然属于KAS-Ⅰ/Ⅱ家族, 但被发现不能催化FabB/F的底物, 而是发挥FabH功能, 所以被认为是FabH的补偿酶[33].

除FabH外, 来自4个菌属的FabB和10个菌属的FabF蛋白结构也已被解析(附表 4), 其三级结构体现出了与FabH极为类似的αβαβα构型, 但FabB/FabF活性口袋底部与FabH存在差异, 这可能与它们不同的底物识别机制有关(图 5c).近期, Milligan等[34-35]开发了共价的氯丙烯或溴探针, 将其附着于ACP的保守活性丝氨酸上, 利用FabB/F活性位点半胱氨酸的亲核性使得二者反应, 从而分别获得了高度保守的共价交联EcFabB-holo-ACP以及带有C-12、C-16脂肪酸链修饰的EcFabB/F-ACP复合物晶体结构. EcFabB-ACP复合物结构显示, 每个EcFabB交联一个ACP, 并通过ACP α2底部与EcFabB形成主要的亲水和疏水相互作用界面, 并受到变构调节或协同作用的影响.其中, ACP α2上关键氨基酸Asp38对EcFabB-ACP的相互作用至关重要(图 5c).

EcFabB/F-ACP复合物晶体结构进一步显示, EcFabB/F的底物结合顺序和反应顺序可能由活性口袋入口处的“守门”苯丙氨酸控制[36]:不同长度的脂肪酸链底物从ACP α2底部的保守丝氨酸侧链延伸到FabB/FabF的活性位点进行催化, 导致了FabB/FabF入口处构象的改变.口袋入口处的Loop1和Loop2采用了“双吊桥”机制, 通过Loop2牵引位于Loop1的“守门”氨基酸F400(EcFabF)使其摆动, 从而让催化通道封闭或开启.这一机制为FabB/FabF如何精确分辨酰基ACP和丙二酰ACP的分步结合提供了一种合理解释(图 5c).

对KAS家族酶的催化机制研究结果证实, 尽管该家族存在高度保守特征, 但不同菌属KAS的催化口袋形状存在显著差别, 这造成靶向KAS的广谱抗生素往往只能抑制部分菌属.目前已报道的KAS抑制剂共有七类:硫代乳霉素(Thiolactomycin, TLM)类、2, 6-二氯苄基吲哚(2, 6-dichlorobenzyl indole)类、苯甲酰氨基苯甲酸(Benzoylaminobenzoic acid)类、联苯骨架(Biphenyl derivatives)类、Platensimycin (PTM)和Platencin (PTN)类、苯并噁唑啉酮(Benzoxazolinone)类以及浅蓝菌素(Cerulenin)(表 3, 附表 5).其中, 靶向KAS家族的非选择性抑制剂主要有模拟KAS家族底物丙二酰ACP的竞争性抑制剂TLM和PTN. TLM通过与FabB中的两个催化组氨酸(H298和H333)形成较强的氢键相互作用, 并结合其不饱和烷基侧链与疏水小口袋形成的π堆积相互作用稳定占据活性口袋, 从而分别对EcFabB、EcFabF和EcFabH体现出了一定的抑制活性(图 5d)[37].而PTN则分别对SaFabF和SaFabH有一定的抑制活性[38].

除了靶向KAS家族的非选择性抑制剂TLM和PTN, 其余几类抑制剂均体现出了显著的家族内选择性. 2, 6-二氯苄基吲哚类化合物抑制肺炎链球菌SpFabH和大肠杆菌EcFabH的酶活[39]; 苯甲酰氨基苯甲酸类化合物则显著抑制革兰氏阳性菌粪肠球菌(Enterococcus faecalis, Ef) EfFabH、肺炎链球菌SpFabH和金黄色葡萄球菌SaFabH以及革兰氏阴性菌流感嗜血杆菌HiFabH的酶活[32].值得注意的是其对EfFabH和SpFabH的抑制IC50达到了4 nmol•L－1, 是强效的抑制剂.联苯骨架类化合物主要抑制大肠杆菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌以及金黄色葡萄球菌FabH[40]. PTM是PTN的类似物, 其通过抑制金黄色葡萄球菌以及大肠杆菌FabF的酶活显著抑制细菌的生长[41].但与PTN广谱抑制KAS家族酶活不同, 目前尚未报道PTM对FabH有抑制活性. Zheng等[42]通过虚拟筛选发现苯并噁唑啉酮类化合物可作为一种潜在的FabB/F抑制剂骨架, 但其对EcFabB的抑制率较差(IC50大于100 μmol•L－1).

此外, 浅蓝菌素是FabB/F的不可逆抑制剂.其与枯草芽孢杆菌BsFabF的晶体结构表明(图 5e), 该抑制剂通过共价结合在反应中心关键活性半胱氨酸Cys163的酰基结合位点, 同时诱发Phe398和Ile108构象重排, 从而抑制FabB/F的酶活.除此之外, 浅蓝菌素对EcFabH也存在微弱的抑制(IC50为700 μmol•L－1), 这可能由FabH的活性口袋底部与FabB/F活性口袋底部存在显著构象差异所造成[37].

脂肪酸延伸阶段的第二步由β-酮酰基-ACP还原酶(β-Ketoacyl-ACP reductase, FabG)承担, 将来自于KAS家族酶的催化产物β-酮酰基-ACP进一步还原为β-羟酰基-ACP. FabG属于短链脱氢酶/氧化还原酶(SDRs)超家族的NAD(P)H依赖型酶[43], 在物种中高度保守.其催化还原机理要求将质子从NAD(P)H的烟酰胺环添加到β-酮酰基-ACP的C3碳原子上, 并将质子通过活性残基Tyr的OH基团提供给C3上的氧, 从而将羰基还原为羟基(图 6a).

(a) FabG反应机制示意图. (b) EcFabG-NADH复合物晶体结构示意图, 缩放图中分别显示了EcFabG在活性构象(黄)和失活构象(青)下与底物NADH(紫)的结合模式. (c) VcFabG四聚体晶体结构.二聚体-二聚体接触界面的二级结构以黑色字体标记. (d)变构抑制剂FG01(紫)与PaFabG复合物结构结合模式示意图.

(a) Schematic diagram of FabG catalytic mechanism. (b) Overall crystal structure of EcFabG-NADH complex. The binding models of NADH (purple) in the active conformation (yellow) and inactive conformation (cyan) of EcFabG are shown. Key residues involved in the binding are shown in sticks and labeled. (c) Overall structure of VcFabG tetramer. The secondary elements on the dimer-dimer contact interface are labeled. (d) The binding model of allosteric inhibitor FG01 (purple) to PaFabG complex. Key residues involved in inhibitor binding from PaFabG A and B subunit are shown in green/cyan sticks and labeled.

目前有来自25种菌属的FabG结构被解析, 其中大部分FabG呈现出四聚体聚合形式(附表 6).以大肠杆菌EcFabG为例, EcFabG整体构象采用了经典的Rossmann折叠, 核心是一个由七个β折叠扭曲平行组成的β折叠片层, 两边覆盖着八个α螺旋.两个右手βαβαβ部分构成结构的中心, 并由螺旋α3连接(图 6b).通过对霍乱弧菌(Vibrio cholerae, Vc) VcFabG的研究发现[44], VcFabG二聚体-二聚体接触界面B上的α4/α5螺旋构象稳定性是促进FabG四聚体形成的重要因素.邻近二聚体界面的两个氨基酸G92和G141 (EcFabG分别为G88和G137)是构象变化的关键, 分别位于β4-α4环和β5-α5环上, 通过结合NADP(H)使得无序环变得有序, 从而稳定α4/α5螺旋的构象形成四聚体.催化残基Y155通过Q152的支持作用(EcFabG分别为Y151和Q148)进一步稳定了该活性构象(图 6c).另外, 辅因子NADP(H)的结合也有利于FabG四聚体形成.

FabG的结构通过其构象差异可进一步分为失活和活性两种构象.在失活构象中(EcFabG、MtMabA、普氏立克次体(Rickettsia prowazeki, Rp) RpFabG和天蓝色链霉菌ScFabG)[44], 保守的Ser-Tyr-Lys催化三联体(SKY)的侧链相距很远, 部分无序的β4-α4和β5-α5环(统称为无序环)屏蔽了NADP(H)结合囊的入口.同时, EcFabG以负协同作用结合NADP(H)[45], 而MtMabA以正协同作用结合NADP(H)[46].而在活性构象中(EcFabG/NADP(H)[47]和MtMabA/NADP+[48]复合物结构), EcFabG的SKY催化三联体则被重新定位到催化活性构象中, 由核糖羟基、SYK三联体和有序水分子组成的氢键网络创建了一条质子线, 以补充催化过程中Tyr残基提供的质子.另外, FabG中的无序环部分在复合物中变为有序环, 并且该有序环结构形成了活性位点的入口(图 6b).这些结构证据表明, 大部分FabG蛋白需要NADP(H)结合才能形成活性构象.然而, 铜绿假单胞菌PaFabG被发现无辅因子结合就可保持活性构象[49].

FabG是多种致病菌中唯一的酮酰基还原酶, 其正常活性的维持对于致病菌的生存至关重要, 因此被认为是重要的抗菌药物靶标[50].目前已报道了多种潜在抑制剂, 如Macrolactin S、多酚类化合物如六氯酚(Hexachlorophene)、(−)-儿茶素没食子酸酯(Catechin gallate, CG)及其衍生物、1, 2, 3, 4, 6-五邻-没食子酸-β-d-葡萄糖(1, 2, 3, 4, 6-penta-O-galloyl-β-d-glucose, PGG)等天然产物提取物, 以及一类多环骨架的变构剂(FG01)等(表 4, 附表 6).

其中, 抑制机理阐述较为清楚的是由Cukier等[49]鉴定的FG01类多环结构的铜绿假单胞菌PaFabG变构抑制剂, 其IC50均在20~200 nmol•L－1)之间.复合物晶体结构表明, 尽管这些多环化合物之间缺乏结构相似性, 但它们都以相似构象结合在FabG的变构位点, 距离催化中心约1.4 nm.该变构位点位于FabG的亚基-亚基接触界面B上, 每个FabG四聚体结合两个抑制剂分子.该结合口袋为疏水性, 由两个亚基的螺旋α4和α5发生构象重排组成(图 6d).研究者认为这种重排将影响β4-α4环和β5-α5环的构象, 从而使得催化三联体(Ser-Tyr-Lys)发生偏移无法结合NADP(H).

除此以外, Macrolactin S是一类24元环内酯, 尽管其对金黄色葡萄球菌SaFabG酶活的抑制能力较弱, 但对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌生长的抑制却较为显著[51].驱虫剂六氯酚及其类似物能有效抑制恶性疟原虫(Plasmodium falciparum, Pf) PfFabG[52]; 而(−)-儿茶素没食子酸酯则是恶性疟原虫PfFabG、PfFabZ、PfFabI的三重非竞争性抑制剂[53]. PGG是从元宝枫(Acer Truncatum Bunge)落叶中提取的天然化合物.它对EcFabG具有抑制活性, 并可抑制金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis, Se)、大肠杆菌、铜绿假单胞菌的生长[54].目前, 这些抑制剂的抑制机理尚不清楚.

脂肪酸延伸阶段的第三步是来自第二步β-酮酰基- ACP还原酶催化生成的产物β-羟酰基-ACP的脱水反应, 这是脂肪酸合成中饱和脂肪酸合成的必须步骤, 也是不饱和脂肪酸合成的起点.在革兰氏阳性和阴性菌中, β-羟酰基-ACP脱水酶(β-Hydroxyacyl-ACP dehydratases) FabZ是高度保守的单功能脱水酶, 主要参与饱和脂肪酸SFA的合成.它识别长度大于10个碳的饱和或不饱和长链脂肪酸底物, 利用活性口袋中的关键催化组氨酸从β-羟酰基-ACP的C2碳原子上提取质子, 而另一个催化谷氨酸与(R)-构象的C3羟基形成氢键, 从而将β-羟酰基-ACP脱水为反式不饱和trans-2-β-烯酰基-ACP用于下一步的还原反应(图 7a).除了参与饱和脂肪酸的合成, 近期还发现FabZ与大肠杆菌脱乙酰基酶(UDP-3-O-(R-3-hydroxymyristoyl)-N-acetylglucosamine deacetylase, LpxC)存在相互调控, 有助于在细菌代谢中维持脂肪酸的适当分布[55].

(a) FabA/Z反应机制示意图. (b) PaFabA单体结构示意图. (c)革兰氏阴性菌(淡绿)、阳性菌(青)中FabZ、FabA以及具菌属特异性的UFA关键酶的相互关系示意图. (d) EcFabA-ACP复合物与HpFabZ-ACP复合物晶体结构示意图. (e)抑制剂吡啶化合物-1(紫)与HpFabZ的结合模式示意图. (f)共价抑制剂3-癸烯基-N-乙酰半胱胺(紫)与EcFabA的共价结合机制和模式示意图.

(a) Schematic diagram of FabA/Z catalytic mechanisms. (b) Overall structure of PaFabA monomer. (c) Schematic diagram of the relationship between FabZ, FabA and bacteria-specific UFA key enzymes in Gram-negative (light green) and Gram-positive bacteria (cyan). (d) Overall crystal structures of EcFabA-ACP and HpFabZ-ACP complex; Key residues involved in the binding of ACP (purple) are shown in sticks and labeled. (e) Two binding models of inhibitor Pyridine-1 (purple) to HpFabZ. Key residues involved in the binding of ACP (purple) are shown in green sticks and labeled. (f) The covalent binding model of inhibitor 3-decenyl-N-acetylcysteamine (purple) to EcFabA.

目前来自8种菌属的FabZ结构被解析(附表 7).结构分析发现, FabZ具有高度保守的聚合形式和三维结构.它们几乎均采用了由三个二聚体亚基组成的风车型高度对称六聚体的聚合形式(恶性疟原虫PfFabZ存在二聚体和六聚体两种聚合形式, 与pH条件有关[56]).每个FabZ单体均采用经典的β+α“热狗”折叠, 即由FabZ蛋白表面的六条反平行β-折叠层(面包层), 包裹着中间一个长的中心α-螺旋(热狗香肠).同时, 两个FabZ单体通过其β折叠层中的β3折叠之间的相互作用, 形成了二聚体亚基, 且每个二聚体亚基中来自两个单体的氨基酸共同相互构成了对称的两个L型催化活性口袋, 其中关键的活性氨基酸His和Glu分别来自不同的FabZ单体(图 7b).

2016年, 本课题组[57]报道了首个幽门螺旋杆菌HpFabZ-holo-ACP复合物晶体结构, 阐明了HpFabZ对ACP底物的动态调控机制.该研究发现HpFabZ六聚体中的二聚体亚基通过位于其单体相互作用界面β3折叠上活性口袋入口处的关键前门氨基酸Tyr100的侧链旋转, 调控蛋白表面β折叠片层的平行移动, 实现了二聚体亚基两个活性口袋交替结合底物ACP并进行催化的跷跷板式催化机制.与此同时, 该研究还阐明了HpFabZ对不同长度脂肪酸底物的装载机制.在ACP结合至HpFabZ的过程中, HpFabZ原本L型的狭长催化口袋被挤压构成了新的Y型口袋, 位于Y型分叉口的后门氨基酸Phe83通过其侧链旋转, 将不同长度的脂肪酸底物分配至不同的口袋底部中, 使其更好地容纳不同长度的底物.更重要的是, 本课题组[58]进一步研究发现, Phe83的侧链旋转还能通过操纵HpFabZ反平行β-折叠层及中央α3螺旋的定向移动来调节HpFabZ六聚体对多个ACP分子的逐步识别和催化.这些研究描绘了HpFabZ对底物蛋白ACP的类似“轴承”式的动态识别和催化调控分子机制:位于活性口袋入口处的前门氨基酸Tyr100和末尾分叉处的后门氨基酸Phe83(轴承钢珠), 围绕该蛋白的中心α3螺旋(轴承内圈), 通过其侧链的摆动调控蛋白表面反平行β-折叠层(轴承外圈)的平行移动, 从而实现HpFabZ六聚体对ACP底物的有序识别和催化(图 7d).除了这些研究, Dodge等[59]随后利用偶联在大肠杆菌EcACP上的共价探针, 获得了EcFabZ与ACP的复合物结构, 从另一个角度确证了FabZ的催化调控机制.

除了单功能脱水酶FabZ, 在绝大部分革兰氏阴性菌中, 还存在FabZ的同源蛋白FabA. FabA具有与FabZ高度保守的一级氨基酸序列, 以及经典的β+α“热狗”折叠三级结构.它主要识别长度小于10个碳的短链脂肪酸底物, 并对其进行与FabZ类似的脱水反应生成反式不饱和trans-2-β-烯酰基-ACP参与下游饱和脂肪酸合成中的第四步还原反应, 这是对FabZ功能的补充[60].然而与FabZ不同的是, FabA主要以二聚体形式存在, 并且除催化脱水反应外, FabA还能将反式不饱和trans-2-β-烯酰基-ACP进一步异构生成顺式不饱和cis-3-β-烯酰基-ACP, 从而进入由FabB介导的不饱和脂肪酸(UFA)合成循环[61].因此, FabA是兼脱水和异构的双功能酶, 是革兰氏阴性菌中连接饱和脂肪酸合成与不饱和脂肪酸合成的关键枢纽.

目前已有4种菌属的FabA结构被解析, 其三级结构与FabZ高度类似(附表 7).然而FabA的关键催化位点氨基酸(His-Asn)与FabZ略微不同(His-Glu).在催化中, FabA的关键催化残基Asp可以去质子化C4, 使得底物从trans-C2-C3双键转化为cis-C3-C4双键, 从而生成cis-3-癸酰基-ACP(图 7a).这种独特的异构活性可能跟FabA接近直线型的活性口袋形状有关(图 7d). Milligan等[62]报道了磺酰基-3-炔基(Sulfonyl-3-alkyne)探针修饰的ACP与EcFabA的催化组氨酸共价耦联后的EcFabA-ACP的复合物结构.该复合物结构揭示了一种可能的ACP结合机制: FabA的阳性区首先与附着在ACP的S36上的4'-Ppt相互作用. ACP接近后锚定FabA, 其螺旋α3被FabA的相互作用残基撬开, 使得ACP稳定在开放的构象中, 允许隔离的底物从ACP中释放出来, 并在ACP疏水腔破坏时插入到FabA的口袋中(图 7d).这些结果提供了一种开关叶片识别机制的证据, 并进一步证实了FabA和FabZ脂肪酸长度偏好性的差异是因为底物结合袋的形状不同从而赋予了酶的区域选择性, 而不是因为活性位点氨基酸存在不同.

除了经典保守的FabZ和FabA, 在不饱和脂肪酸合成中, 参与脱水反应的酶存在显著的种属特异性, 是研发靶向特定病原菌抗菌药物的重要药物靶标群.在大多数革兰氏阴性菌中, SFA向UFA转变主要由FabA催化完成.然而在幽门螺旋杆菌体内, 则是由一种双功能脱氢异构酶FabX来实现[63]. FabX将饱和的β-癸酰基-ACP催化脱氢反应, 生成trans-2-癸烯酰基-ACP, 并进一步将其异构为cis-3-癸烯酰基-ACP, 从而进入不饱和脂肪酸合成循环.这是一种新颖的回溯机制, 逆转了SFA合成, 使脂肪酸延伸中第四步的产物通过反向催化脱氢再异构, 从而生成UFA.除此之外, 革兰氏阳性菌也普遍不存在FabA基因, 且它们的替代酶多具有菌株特异性(图 7c).目前已知粪肠球菌和嗜盐四联球菌采用类似FabA的双功能脱水异构酶FabN, 将β-羟基癸酰基-ACP脱水并异构为cis-3-癸烯酰-ACP[64]; 而绿色气球菌也采用具有双功能脱水异构酶活性的FabZ同源蛋白FabQ, 但与FabN的底物不同, 它将β-羟基十二烷酰基-ACP脱水再异构生成cis-3-十二烷烯酰-ACP, 从而合成UFA[65].肺炎链球菌则采用不具备脂肪酸脱水活性的单功能异构酶FabM, 将脱水酶FabZ的产物trans-2-癸烯酰-ACP异构为cis-3-癸烯酰-ACP, 并进入UFA合成[66]; 分子建模显示FabN和FabQ在结构上偏向于FabZ六聚体的形式, 而FabM在溶液中为四聚体形式, 且属于水合酶/异构酶超家族成员, 与“双热狗”折叠没有相似性.此外, 枯草芽孢杆菌采用冷刺激诱导的膜磷脂脱饱和酶DES (Desaturase)在有氧条件下使得棕榈酸去饱和化产生cis-5-十六烯酸[67], 但该途径已不在脂肪酸合成系统之内. UFA对于细菌维持细胞膜磷脂的结构和功能以及发挥毒力具有重要的意义[8], 但到目前为止, 相关研究还处于起步阶段.

鉴于FabZ/FabA在饱和脂肪酸/不饱和脂肪酸合成中不可替代的枢纽作用, FabZ/FabA被认为是极具吸引力的药物靶标.目前已报道了种类丰富的FabA/Z抑制剂(表 5).靶向FabZ的抑制剂主要分为合成化合物和天然产物两大类型.在合成化合物中, NAS-91是2003年由Sharma等[68]首次报道的FabZ抑制剂.它以竞争性方式阻止巴豆酰辅酶A (FabZ底物类似物)与恶性疟原虫PfFabZ的结合, 抑制恶性疟原虫脂肪酸的合成, 阻碍了恶性疟原虫在培养物中的生长.此外, Zhang等[69]在2008年报道了靶向HpFabZ的抑制剂吡啶化合物-1 (Pyridine-1).通过HpFabZ-Pyridine-1复合物结构显示该化合物分别通过与HpFabZ活性口袋入口处前门氨基酸Tyr100相互作用以占据活性口袋入口, 或通过插入活性口袋末端阻止脂肪酸底物进入的方式抑制HpFabZ的酶活(图 7e).在此基础上, 该课题组[70]基于复合物结构信息通过多轮化合物结构改造, 进一步获得了抑制活性和选择性更强的2-萘酚取代吡啶化合物.

除此之外, 多类天然产物也被发现具有FabZ抑制活性, 例如类黄酮类化合物槲皮素(Quercetin)、芹菜素(Apigenin)和(S)-樱花素(Sakuranetin), 胡桃醌(Juglone), 大黄素(Emodin), Stictic acid和Mangostin等.在类黄酮类抑制剂中, 前文提及的(−)-儿茶素没食子酸酯是恶性疟原虫PfFabG、PfFabI以及PfFabZ的三重抑制剂, 其对HpFabZ同样具有抑制活性[53]; 而Zhang等[71]发现的槲皮素(Quercetin)、芹菜素(Apigenin)以及(S)-樱花素(Sakuranetin)对HpFabZ具有显著抑制效果, 并有效阻碍幽门螺旋杆菌的生长. Juglone和Emodin均可抑制HpFabZ的酶活, 且抑制幽门螺杆菌SS1和ATCC 43504菌株的生长[72].天然产物Stictic acid和Mangostin被报道可作为鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis, Yp) YpFabZ的竞争性抑制剂, 其抑制机理推测与前面报道的吡啶化合物-1的抑制机理可能类似[73].

尽管FabA与FabZ高度保守, 但从抑制剂的发现来看, FabA与FabZ的抑制剂存在显著的不同.目前已报道的FabA抑制剂有共价自杀性抑制剂3-癸烯基-N-乙酰半胱胺(3-decynoyl-acetylcysteamine)和非共价抑制剂N42FTA. 3-癸烯基-N-乙酰半胱胺是靶向FabA的底物类似物自杀性共价抑制剂, 它通过模拟底物进入FabA活性口袋, 并与FabA催化残基His通过炔丙基重排反应进行共价连接, 堵住FabA催化口袋, 导致FabA失活(图 7f)[74].除了用于FabA的活性抑制, 该类化合物近年更倾向于被用于研究脂肪酸合成途径酶系与底物ACP的调控机制研究.利用该化合物的共价交联原理, 将ACP与酶共价交联(FabA-ACP[62]、FabZ-ACP[59]), 从而通过复合物结构解析研究阐明其机理.此外, 除了共价抑制剂, Naismith课题组[75]经高通量筛选发现了第一个靶向FabA的非共价抑制剂N42FTA. N42FTA与PaFabA的复合物晶体结构表明, N42FTA通过与FabA活性口袋中的氨基酸(A195主链、H70和G79侧链)相互作用, 填充了结合底物酰链的疏水活性口袋, 从而抑制FabA的酶活(附表 8).

脂肪酸延伸阶段最后一步催化反应由β-烯酰基- ACP还原酶(β-Enoyl-ACP reductase, FabI)承担, 将trans-β-烯酰基-ACP的双键还原生成饱和脂肪酸, 是FAS-Ⅱ延伸阶段的最终酶, 并根据发现时间的先后分为四个亚型. FabI是细菌中最先鉴定的β-烯酰基-ACP还原酶, 大部分FabI通过有序的乒乓机理(Ping-Pong mechanism), 将先于底物结合的辅因子NADH的氢原子转移到脱水酶产生的碳-碳(C2-C3)双键上, 随后C1的羰基氧原子形成烯醇式阴离子并发生互变异构从而完成酰基链的合成(图 8a).

(a) FabI反应机制示意图. (b) EcFabI单体结构示意图. (c) EcFabI(绿/蓝/青/粉)-ACP(黄/红)复合物晶体结构示意图. (d) EcFabI(绿)与BsFabL(黄)涉及质子传递和NADH(紫)结合关键区域的结构叠合图. (e) XoFabV单体结构示意图. (f) TmFabK单体结构示意图. (g)抑制剂异烟肼-NAD(紫)与InhA的结合机制和结合模式示意图. (h)抑制剂三氯生(紫)与SaFabI的结合模式示意图.辅助因子NADP+显示为黄色. (i)抑制剂PT173(紫)与YpFabV的结合模式示意图. (j)抑制剂苯基咪唑化合物1(紫)与SpFabK的结合模式示意图.辅助因子FMN显示为黄色.

(a) Schematic diagram of FabI catalytic mechanism. (b) Overall structure of EcFabI monomer. (c) Overall structure of EcFabI (green/blue/cyan/pink) in complex with ACP (yellow/red). (d) Superposition of proton transfer and NADH binding regions of EcFabI (green) and BsFabL (yellow). (e) Overall structure of XoFabV monomer. (f) Overall structure of TmFabK monomer; (g) The binding mode of inhibitor isoniazid-NAD (purple) with InhA. (h) The binding mode of inhibitor Triclosan (purple) with SaFabI. The ligand NADP+ are shown in yellow stick. (i) The binding mode of inhibitor PT173 (purple) with YpFabV. (j) The binding mode of inhibitor Phenylimidazole compound 1 (purple) with SpFabK. The ligand FMN is shown in yellow stick.

目前已有来自22种菌属的FabI结构被解析(附表 9), 它们的结构相似且保守. FabI与FabG一样, 属于短链脱氢酶/氧化还原酶(SDRs)超家族.大肠杆菌EcFabI结构显示为Rossmann折叠, 核心由七个β折叠组成, 核心两边共覆盖六个α螺旋(图 8b). FabI保守的催化氨基酸为酪氨酸和赖氨酸残基, 它们间隔六个氨基酸(Y-X6-K, FabG为Y-X3-K), 这是FabI的特征之一.大部分FabI需要形成四聚体发挥酶活, 这是因为二聚体过渡到四聚体的过程中发生了活性位点的重排以及NADH的结合.蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus, Bc) BcFabI和金黄色葡萄球菌SaFabI则是二聚体[76]. Rafi等[77]解析了大肠杆菌EcFabI与ACP的复合物晶体结构显示ACP与FabI四聚体结合的比例为1:2.但由于分辨率的原因, 只能观察到ACP的α2螺旋与FabI的α8螺旋的接触(图 8c).在结核分枝杆菌中FabI被命名为MtInhA, 它对长链脂肪酸底物具有特异性, 是异烟肼(Isoniazid, INH)特异性的作用靶标.

FabL和FabV是对β-烯酰基-ACP还原酶FabI的补充.它们是新发现的一类短链脱氢酶/氧化还原酶.已有来自2种菌属的FabL结构被解析, FabV则为4种(附表 10). FabL最先在枯草芽孢杆菌中与FabI一起被鉴定出来, 二者结构非常相似且具有显著的同源性.此外作为FabI特征的催化序列Y-X6-K在枯草芽孢杆菌中的位置与BsFabL一致.但是就结构进化而言, FabL更接近FabG, 因为FabL在质子传递所涉及的残基是Asn而不是FabI中的Tyr, 这代表FabL与FabG的催化机制更为相似(图 8d). FabL可以在FabI缺失的情况下补偿FabI的生物功能[78].

FabV最早在霍乱弧菌中被鉴定出来, 且在鼠疫耶尔森氏菌中是唯一的烯酰基-ACP还原酶[79].以水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae, Xo) XoFabV为例, 其和FabI都具有Rossmann折叠核心, 但它们的聚合形式以及整体结构有很大的不同: FabV为单体, 而FabI通常为四聚体. XoFabV比EcFabI约大60%, 组成折叠中心的β-折叠及其两侧的α-螺旋发生了移位, 并且FabV含有围绕Rossmann核心的额外二级结构, 包括螺旋α1和α11~α13以及链β5~β8和β11(图 8e).这些额外的二级结构元件被认为可以充分稳定FabV及其底物结合口袋, 因此不需要同较小的SDR家族成员那样通过二聚体或四聚体进一步稳定.此外XoFabV的催化基序与FabI/L存在差异, 为Y-X8-K[80].鼠疫耶尔森氏菌YpFabV的关键氨基酸T276位于底物结合环的N末端, 通过结构研究与定点突变相结合表明, 该残基的改变可调节活性位点门的大小[79].最近, Kim等[81]在土壤基因组中分离到一种FabI的同工酶, 并命名为FabMG (PDB号码: 6KI9、6KIA).它与已知的烯酰基-ACP还原酶没有序列相似性, 但具有相同的Rossmann折叠核心和额外的二级序列结构, 其催化基序为新型的Y-X5-K.

细菌中还存在FabI的同源蛋白烯酰基-ACP还原酶FabK.目前, 已有来自3种菌属的FabK结构被解析(附表 10). FabK在一些菌属中与FabI共存, 是FabI功能的重要补充, 但在一些特定菌属中则单独存在, 是FabI功能的替代.例如, 在肺炎链球菌和艰难梭菌(Clostridioides difficile, Cd)等菌属中不存在FabI, 取而代之的就是FabK[82]. FabK与FabI/L/V/MG的结构存在本质的差异.海栖热袍菌(Thermotoga maritima, Tm) TmFabK显示为TIM桶(Triosephosphate isomerase-barrel)状蛋白折叠结构, 每个亚基的三维结构中都包含位于外部的8个α螺旋和位于内部的8个平行β链, 呈现为花朵状(图 8f). FabK采用二聚体构象, 不同于四聚体FabI.该蛋白的活性中心含有辅因子FMN, 同时也需要NAD(P)H才能发挥其酶促活性. FabK是肺炎链球菌中唯一的烯酰-ACP还原酶, 此外在粪肠球菌和铜绿假单胞菌等病原体中发现了FabI和FabK共存的情况.目前FabK的催化机制仍不清楚, 可能为乒乓催化机制: FabK的辅因子FMN接受NADH的两个氢被还原为FMNH2, FMNH2再将C2-C3碳-碳双键还原成单键[82].

这些FabI同工酶的出现, 加深了对烯酰基-ACP还原酶抑制剂的理解, 也补充与完善了针对FabI的抑制剂的设计思路.至今主流的抑制剂靶标仍为FabI, 而选择性抑制FabL的抑制剂并未报道, 因为其与FabI具有较高的相似性.目前已报道的靶向FabI的抑制剂有三氯生(Triclosan)类衍生物、氨基吡啶(Aminopyridine)类衍生物、吲哚萘啶酮(Indolenalidone)、咪唑(Imidazole)类衍生物、2, 9-二取代1, 2, 3, 4-四氢吡啶并[3, 4-b]吲哚(2, 9-disubstituted 1, 2, 3, 4-tetrahydropyrido[3, 4-b]indoles)、Kalimantacin、二氮卓酮(Diazepone)及螺环萘啶酮哌啶(Piperidine)类衍生物、临床药物异烟肼(Isoniazid)及进入临床的AFN-1252类衍生物(表 6, 附表 11).

三氯生是较早报道的靶向FabI的抑制剂之一[83], 其抑制机制已被详细阐明:三氯生结合在FabI的活性口袋, 其酚环占据了FabI辅因子腺苷酸的位置, 和NAD+烟酰胺环形成π-π堆积作用.同时, 与FabI活性口袋周围的残基形成广泛的范德华力.其中EcFabI的Tyr156位是抑制剂结合的关键氨基酸, 它可以提供一个稳定的氢键.这些相互作用使三氯生、FabI及其辅因子NADH三者形成稳定的三元复合物从而抑制FabI(图 8h).同时, 三氯生作为一种广谱抑制剂, 对革兰氏阳性菌、阴性菌的生长都有抑制作用.除此之外, 以下化合物的抑制机理都与三氯生类似, 包括了靶向金黄色葡萄球菌SaFabI和流感嗜血杆菌HiFabI, 并对金黄色葡萄球菌和卡他莫拉氏菌具有良好体外抗菌活性的低微摩尔抑制剂氨基吡啶衍生物[84]; 靶向SaFabI、HiFabI和大肠杆菌EcFabI, 以及肺炎链球菌SpFabK, 并对金黄色葡萄球菌具有较好体外抗菌活性的FabI/FabK纳摩尔级双重抑制剂吲哚萘啶酮类化合物[85]; 靶向SaFabI和EcFabI的1, 4-二取代咪唑类化合物[86]; 靶向SaFabI和EcFabI并有效抑制金黄色葡萄球菌和卡他莫拉氏菌生长的2, 9-二取代1, 2, 3, 4-四氢吡啶并[3, 4-b]吲哚类衍生物[87]; 靶向SaFabI和EcFabI的二氮卓酮(Diazepone)类抑制剂及其螺环萘啶酮哌啶(Piperidine)类衍生物[88-89].此外, 近期Kalimantacin及其衍生物被鉴定为一种新型的靶向FabI的有效抑制剂[90].它们可显著抑制SaFabI的酶活, 并有效抑制金黄色葡萄球菌的生长. Kalimantacin A (KLA)与SaFabI-NADH的复合物晶体结构显示它结合在FabI活性部位, 所占表面积是三氯生的近两倍, 导致底物结合环被破坏(残基G191~G203), 从而抑制SaFabI的酶活.

除了上述抑制剂, 异烟肼是靶向FabI的缓慢、紧密结合型强效竞争性共价抑制剂, 目前是临床抗结核病的一线药物.它作为一种前药, 在体内激活后其酰基吡啶片段共价连接至NADH的C4位置, 形成INH-NAD共价加合物, 进而与结核分枝杆菌MtInhA形成抑制性二元复合物(图 8g).另外, 近年来新发现的一类FabI抑制剂AFN-1252也已经进入临床试验, 它具有显著抑制含不同抗性的金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌生长的良好抑菌活性, 被临床上用于治疗革兰氏阳性菌引起的急性皮肤和皮肤结构感染[91-92].同时, 基于预测工具eNTRyway设计的AFN-1252上萘啶酮环3号位被胺基取代的衍生物AFN-1252-NH3, 不仅在革兰氏阳性菌抑菌测试中表现出了媲美AFN-1252的活性, 更重要的是在具有完整外膜的大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae, Kp)和鲍曼不动杆菌等阴性菌株中也展现了优秀的活性[93], 被认为是取代异烟肼的极有潜在应用前景的新型临床抗菌药物.

由于FabI在细菌脂肪酸合成中的重要作用, 大量的抑制剂被发展.然而, 大部分抑制剂在抗菌测试中均体现出较强的耐药性, 能进入临床的少之又少.进一步研究发现, 特定菌属中存在的FabI同源蛋白FabV、FabK对FabI功能的补偿是这些菌属体现耐药性的主要原因, 因此, 发展靶向FabV和FabK的特异性抑制剂具有重要的临床意义(附表 12). YpFabV是鼠疫耶尔森氏菌中唯一的烯酰-ACP还原酶.靶向YpFabV的抑制剂主要分为具有吡啶酮和二苯醚骨架的两类抑制剂[79].其中化合物PT173(图 8i)抑制YpFabV的机制与三氯生抑制FabI的机制相似(图 8h).然而, 三氯生类化合物对FabV具有极其微弱的抑制活性.这种选择性差异可能是由于FabV独特的底物结合环移动造成的.目前FabK抑制剂的报道相对FabI较少, 除了前文所述的FabI和FabK双重抑制剂吲哚萘啶酮类化合物及苯基咪唑衍生物[85](图 8j), Ozawa等[94]报道了一类特异性靶向肺炎链球菌SpFabK的苯基咪唑衍生物, 能通过显著抑制SpFabK的酶活来抑制肺炎链球菌的生长.该类化合物与SpFabK的复合物晶体结构解析显示, 抑制剂结合在FabK活性中心的疏水口袋上, 通过与FabK辅助因子FMN形成面对面的π-π堆积作用, 并伴随着两个环区的诱导拟合运动来稳定在FabK的活性口袋中, 阻止NADH的结合和后续的脂肪酸催化[82].最近, Jones等[95]进一步对该类化合物进行改造, 获得了可以靶向艰难梭菌CdFabK的新型选择性抑制剂.

脂肪酸生物合成是所有生物中必须存在的基本通路, 具有不可替代的重要作用.它分为存在于哺乳动物及真菌中的FAS-Ⅰ, 及存在于细菌、植物及线粒体中的FAS-Ⅱ, 且具有高度保守和极其类似的催化机理.因此, 研究FAS-Ⅱ酶系的分子机制对于深入理解细菌和人类脂肪酸合成的生物功能均具有重要意义.目前, FAS-Ⅱ系统中所有催化步骤的酶, 以及FAS-Ⅰ系统中除脱水酶活性结构域(DH domain)之外活性结构域的晶体结构都已被解析, 分子催化机制也有一定程度的阐明.然而, 长期以来对该领域的研究长时间停止在了这一层面, 对于FAS系统酶系/酶活中心的识别调控机制的研究一直处于空白.主要原因有两个: (1)由于ACP需要经过翻译后修饰和激活后才具有生物功能, 而这一修饰在体外缺乏优秀的化学生物学工具进行构建; (2)为了提高脂肪酸合成的效率, FAS系统的酶系均采用“蜻蜓点水式”的ACP“快速结合”-“快速催化”-“快速解离”的“三快”识别和催化调控模式, 这直接导致了FAS-Ⅰ和FAS-Ⅱ系统酶系对底物载体蛋白ACP的识别和调控机制研究无法顺利开展, 并造成了长达数年的对脂肪酸合成途径生物功能深入理解的瓶颈期.值得庆幸的是, 近年来随着化学生物学的快速发展, 包括本实验室在内的一些实验室通过发展了ACP的体外化学修饰技术, 并以其为天然化学生物学工具阐明了FAS-Ⅱ系统酶系对ACP的识别和调控分子机制; 另外一些实验室则发展了携带有共价探针的人造ACP化学生物学工具, 通过FAS-Ⅱ酶与共价探针发生共价反应的方式来阐明相关机制.这些工作突破了脂肪酸合成途径研究领域的关键瓶颈, 为相关机制和功能的研究提供了全新的化学生物学工具和研究思路, 也为进一步理解FAS系统的调控机制和生物功能以及相应的药物研发奠定了重要的理论基础.

尽管FAS-Ⅰ和FAS-Ⅱ都遵循类似的催化机理, 但是二者在组织结构及对底物载体蛋白ACP的识别和调控机制上存在本质区别, 这意味着靶向FAS-Ⅱ酶系的药物不会对人体FAS-Ⅰ产生重要的影响.因此, 根据人与细菌在脂肪酸合成中的机制差异来发现与设计新型抗菌药物, 是治疗细菌性感染疾病的有效方法[96].然而, 虽然目前已经报道了大量靶向细菌FAS-Ⅱ酶系和FAS-Ⅰ活性催化中心的抑制剂, 但尚未有顺利完成临床试验的药物上市; 另一方面, 由于FAS-Ⅱ酶系在细菌中高度保守, 这导致靶向FAS-Ⅱ酶系的抗菌抑制剂普遍缺乏选择性, 严重破坏人体肠道益生菌群的稳态; 同时FAS-Ⅱ酶系与FAS-Ⅰ催化中心的高度类似也造成这些抑制剂对人体存在巨大的毒副作用风险.这些因素使得目前尚无靶向脂肪酸合成途径的特异性临床药物问世.随着FAS酶系对ACP的调控机制逐步开始阐明, 靶向该途径的另一种药物发现策略浮出水面:即发展能破坏底物载体蛋白ACP与FASⅠ和FAS-Ⅱ酶活中心的蛋白-蛋白相互作用, 从而阻止脂肪酸长链伸入催化酶的酶活口袋进行下一步的脂肪酸合成反应的新型抑制剂.这种策略目前还没有成功的抑制剂报道, 但必将成为一种可行的方法, 应用在靶向脂肪酸合成途径的全新重要药物的开发中.