WB做得好，导师捡到宝。对于刚入实验室的热血青铜宝宝，WB可谓处处都是轰炸区，一个不小心，分分钟落地成盒。为了帮助大家快速get变强秘籍，提升吃鸡率，我们在此重磅推出《WB实验全攻略》系列文章，助力各位早日成为实验室MVP，进阶WB无敌战神。

在上一期的分享中，我们介绍了如何湿转 (WB的无敌战神之路——转膜)，今天将接着介绍封闭，我们开始吧～

封闭的目的：

蛋白通过非共价作用力吸附于膜表面，但是膜上很多位置并未吸附蛋白，封闭液中的蛋白成分可以与膜表面的空白位置结合，从而避免一抗的非特异性结合，产生非特异条带或者背景杂乱。

正确的封闭液可以促使抗原抗体更好的结合。对于封闭液的选择，可以通过抗体说明书确定有无特殊的封闭方法，也可根据实验结果进行相应调整。小编在这里给大家总结了常见的封闭液以及它们的优缺点。

Ⅰ 脱脂奶粉

脱脂奶粉成分复杂，含有多种蛋白，封闭全面。大部分情况下，脱脂奶粉是首选的封闭液 (浓度2.5-5% w/v)，经济实惠，可以达到较好的封闭效果。但因含少量残留的生物素和碱性磷酸酶 (AP)，它不适用于生物素标记和AP标记的抗体系统。脱脂牛奶也不适用于磷酸化蛋白的检测分析，因为奶粉中含有的酪蛋白是一种磷酸化蛋白，会导致抗体的非特异性结合，使条带背景变脏。

Ⅱ 牛血清白蛋白 (BSA)

脱脂奶粉不能用于磷酸化蛋白的封闭，分析磷酸化蛋白理论上要用BSA (浓度2-5 % w/v)。WB结果显示，相较于脱脂奶粉，BSA更适用于磷酸化蛋白的检测。遥想当年，我还不知道磷酸化蛋白封闭需要用BSA，一个磷酸化蛋白我整整跑了一个月，总是背景高，血的教训哪！虽然BSA成分单一，但普通级别的BSA可能含有IgG或其他血清蛋白，这些蛋白会与哺乳动物抗体 (如抗牛、山羊、绵羊、马等二抗) 产生交叉反应，增加非特异性背景信号，因此建议使用不含IgG的BSA产品。相对于脱脂奶粉，BSA不含生物素，对于生物素标记的抗体系统而言，可能BSA是最好的选择。

Ⅲ 血清

血清如胎牛血清FBS含有大量的蛋白质，可以用于封闭。但与BSA一样，它含有免疫球蛋白和血清蛋白，这些蛋白会和哺乳动物抗体产生交叉反应，增加非特异性背景信号。而且血清价格更加昂贵，需要的浓度更高 (5-10 % w/v),因此在WB实验中血清一般用的较少，它更多地应用于免疫组化和免疫荧光实验中样本的封闭。

Ⅳ 明胶

明胶是胶原蛋白的产物，从冷水鱼皮肤中提取出来的明胶即使在低温情况下也不会凝固，通常使用浓度为0.1-5 % (w/v)。与BSA和血清不同，它不含任何血清蛋白，因此不会和哺乳动物抗体产生交叉反应，这大大降低了非特异性背景信号。但鱼胶含有内源生物素，因此不适用于生物素标记的抗体系统。

Ⅴ 混合封闭液

有研究表明[1]，混合型液封闭效果 (脱脂奶粉+BSA+FBS+明胶) “秒杀”前四种封闭液。如图1所示，不难看出，混合型封闭液的封闭效果最好，信号最强 (该实验使用的是HRP标记的抗体系统)。

Ⅵ 酪蛋白

相对于AP标记二抗，HRP标记二抗灵敏度更高，酶促反应更快。绝大多数实验室用的都是HRP标记二抗。如果有实验室用的是AP标记二抗，小编建议用1 % w/v的酪蛋白进行封闭。酪蛋白在中性和碱性条件下带有负电，会与带正点的膜相互作用，可以用于AP标记的抗体检测系统，缺点是溶解性相对较差~

01、转膜结束前30 min，以TBST为缓冲体系 (配方见文末) 配置封闭液，并利用涡旋仪、摇床等仪器使封闭液充分溶解并混匀；

02、转膜结束后，在抗体孵育盒中加入适量封闭液，并用镊子夹住条带，将其完全浸泡在封闭液中，置于摇床上室温摇动孵育1-2 h，也可以4 ℃冰箱孵育过夜。

WB的结果不理想有很多原因，下面我们就分析一下封闭可能会导致的问题吧～

1. 条带上有黑色斑点

奶粉未完全溶解。出现黑点最常见的原因是奶粉没有完全溶解，建议利用涡旋仪、摇床等仪器使奶粉充分溶解并混匀，或溶解后离心取上清液使用。

2. 条带背景高

封闭时间过短。封闭的目的是使封闭液中的蛋白成分与膜表面的空白间隙结合，从而避免一抗的非特异性结合。封闭时间过短可能会导致一抗与空白间隙非特异性结合，背景变脏，可以增加封闭时间，或提高封闭液浓度。

3. 条带信号弱过度封闭。

条带信号弱，可以适当降低封闭液浓度，或者更换封闭液，封闭时间如果过长也可以考虑降低，但如果原本时间是1 h，不建议再缩短时间。但封闭过度很少见，条带信号弱可能要优先考虑其他条件，比如样品新鲜度、上样量、一抗二抗浓度等。