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随着现代生物技术的高速发展，生物医药创新取得了一个个举世瞩目的成绩，CAR-T细胞治疗、ADC药物、核酸类药研发的不断进步，都离不开关键技术的突破。2020年新冠病毒mRNA疫苗的成功问世，是需求推动技术发展的又一个典范。这些突破性的关键技术还面临着哪些挑战？它们的发展远景如何？

Science Café

2月26日，第32期 science café活动特别邀请到了复旦大学生命科学学院林金钟教授和华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室谭文松教授，与大家分享mRNA药物研发中的关键卡脖子技术与动物细胞大规模培养技术面临的挑战和发展机遇。

▲两位嘉宾在现场做报告（左：林金钟、右：谭文松）

以下是嘉宾报告分享的精彩内容

聚焦主题一：mRNA药物技术

mRNA药物是即蛋白质药物开发后生物药物开发的新趋势

随着生命科学与技术的快速发展，我们已经熟练地掌握了蛋白质相关的各类技术，能够生产出各种蛋白质类药物应用于临床治疗。而下一阶段，人类是否可以研发DNA药物或者RNA药物？根据生命科学的中心法则DNA转录RNA后翻译表达蛋白质的过程，与蛋白质药物对标，操控DNA需要跨越两个知识鸿沟，而mRNA药物研发的可行性和可控性空间较大。现阶段mRNA药物从研发速度、靶点选择、安全性和疗效稳定性等几个方面，均优于蛋白质药物，如mRNA药物可借助成熟的研发技术平台快速研发，与抗体药物相比，不需要进行蛋白质纯化工艺研究，成药较快，mRNA新冠疫苗的成功便是很好的例子；另外，mRNA药物靶点丰富，胞内与胞外均可靶向目标蛋白；在安全性方面，mRNA仅存于细胞质中，没有整合入基因组的风险，mRNA分子经优化后免疫原性较低，且半衰期短，代谢产物纯天然，这些特点均显示了mRNA药物具有较好的安全性；而在疗效方面，mRNA的蛋白表达动力学表现稳定一致，且功能蛋白质带天然修饰，这两点均保障了mRNA较好的疗效稳定性。

纵观mRNA药物发展历程，我国mRNA药物开发仍处于起步阶段

mRNA从1961年首次被发现至今已经历了几十年的发展，在mRNA发展历程中出现过三次历史性转折点，第一次是1992年，首次发现直接注射mRNA到小鼠脑部可以改善疾病，第二次是2005年，首次发现化学修饰的mRNA可以降低免疫原性，解决因免疫原性引起的毒副作用，第三次是2015年，LNP(脂质纳米粒)技术首次用于mRNA药物递送，解决了mRNA药物递送难的问题，LNP技术递送技术和mRNA修饰技术的成熟促使mRNA药物快速发展，开展了大量的临床试验，至此mRNA药物发展进入了爆发式增长期。

图（一） mRNA药物发展历史

相比国际mRNA药物的研发进程，国内mRNA药物开发正处于起步阶段，面临着大量的问题与挑战，如基础研究严重落后，核心原料严重依赖进口，生产工艺和制剂不成熟等问题。从mRNA领域发表的相关文章数量可以了解到，我国基因表达调控领域主要聚焦在转录调控研究，发表相关文章数量约占世界的1/5，而mRNA的翻译调控仅占世界的千分之一，远远落后于全球水平，至于mRNA药物开发领域，国外自2009年mRNA药物发展进入爆发增长期，论文数指数增长，40个药物处于临床，而中国mRNA药物研发寥寥无几。

mRNA药物分子原料供应紧张，合成工艺复杂，关键技术有待突破

mRNA从从合成到制剂所需原料也多达数十种, 原料供应链也非常紧张, 虽然中国有些企业也参与了国外制药公司mRNA原材料供应，但只仅限于常规的成分, 少数核心原料还在突破中。除了原料, mRNA药物分子复杂，合成比较困难，包括mRNA的加帽、修饰核苷酸、合成酶选择、和mRNA包裹原料分子合成等工艺技术均需要改进。

mRNA分子合成首要关键技术是5’端加帽的工艺开发，无帽（无活性）mRNA是mRNA药物毒性的重要来源。传统合成mRNA采用的是酶学加帽法，如体内天然合成RNA反应一样，先合成mRNA分子后加帽。但该方法缺点很多，如加帽效率严重依赖于mRNA序列的长度，序列越长加帽效率很低；加帽反应需要加热，增加了mRNA降解的风险；另外酶活不稳定，工艺放大困难，最重要的一点是目前没有工艺能够分离有帽和无帽的mRNA。除了酶学加帽法，还有另一种合成工艺，称为“共转录加帽法”，即在mRNA转录合成的第一步将“帽子”结构加上。第一代共转录加帽法并未被生产工艺采用，主要是因为其加帽率低，仅为30%，仅有1/3具有活性，且mRNA分子引入的Cap-0帽子结构会引起很强的免疫原性。第二代共转录加帽法改进了“帽子”分子结构，解决了合成酶不能识别正反向接入“帽子”问题，加帽率提高到了70%，但仍然是Cap-0结构，没有解决免疫原性问题。近几年共转录加帽法取得了重大突破，第三代共转录加帽法通过化学合成法直接合成带有Cap-1结构的mRNA“引物”分子，加帽率高达95%，极大地提高了mRNA分子活性。这个技术目前只有极少数几家制药公司掌握。

mRNA分子合成的另一个关键技术是mRNA序列的优化问题。同一个蛋白质可以由无穷的mRNA分子编码，mRNA分子的不同序列与蛋白质的表达能力、半衰期和免疫原性有着直接关系，如何从成千上万的mRNA分子中筛选出最优分子序列是mRNA药物研发的关键。优化mRNA分子可从mRNA分子的5’端帽子、非编码区、编码区及poly-A尾巴等结构区进行，如加帽修饰的优化可提高mRNA的稳定性；非编码区的优化可通过操控翻译起始位点，影响蛋白质表达；编码区的优化可提供蛋白质表达效率；poly-A尾巴的优化可提高mRNA的半衰期等，每个区域都有很大的优化空间。但已有的优化分子专利保护范围广，新的改进分子很难突破现有专利保护范围，就一个非编码区的优化而言，CureVac’s公司就拥有百万个不同的UTR库。优化mRNA分子可以直接将药物活性提高几十倍、上百倍，甚至更高数量级，所以优化mRNA分子序列具有重要的研究价值。

mRNA药物递送系统面临挑战，专利保护壁垒仍难突破

除了mRNA药物合成工艺的关键技术有待突破，药物递送系统也是制约mRNA药物开发的卡脖子技术问题。第一代药物递送系统的鱼精蛋白和第二代药物递送系统的脂质体，均因毒性高和活性低制约了mRNA药物的成药性研究，直至2015年，LNP技术（脂质纳米粒）成功应用于mRNA药物临床研究，大大提高了mRNA药物的活性，同时降低了毒副作用。2020年新冠疫苗也是采用了LNP载药技术成功上市，LNP技术加速了mRNA药物发展的进程。但LNP技术的专利竞争非常激烈，主要在于阳离子脂分子结构的改造，阳离子脂分子是LNP技术的核心，影响着mRNA药物的递送效率、代谢稳定性、毒性等，而阳离子脂分子可改造的空间较小，从Alnylam、Moderna和BioNTech公司公开的专利中可以看出，各公司对阳离子脂分子结构进行较小改造即会对载药的稳定性产生巨大影响，LNP技术专利保护壁垒仍难突破，开发新型递药系统是mRNA药物开发面临的挑战。

聚焦主题二：细胞培养技术

细胞培养技术是生命科学和临床医学研究的基础手段，更是生物制药的核心技术

细胞是生命体中最小的生命单位，首先我们需要从细胞着手，认识人类和人类生老病死的奥秘，因此细胞培养是生命科学和临床医学研究的基础。其次，细胞培养可以为我们生物制药行业服务，生产提供生物医药产品，包括蛋白制品（细胞因子、酶、抗体等）、病毒疫苗和载体、以及细胞产品等，因此研究细胞培养技术对推进生物医药行业发展具有重要意义。

动物细胞培养至今已有约100多年的历史，但真正意义上的细胞培养始于上世纪30年代，自我们拥有了膜过滤技术后，培养细胞就可以在无菌条件下进行，人类才真正能养活细胞了。随着70年代杂交瘤技术、重组DNA技术的诞生和80年代OKT3单克隆抗体等生物技术药物的上市，细胞培养技术开始往工业化方向发展。虽然在80年代大规模培养细胞仍然面临着巨大挑战，但随后抗体药物产业的兴起推动了细胞培养技术的进步，特别是近30年抗体药物的高速发展，动物细胞大规模培养技术才迎来了快速发展期。

图（二）细胞培养技术发展历程

（来源Wei-Shou Hu, Cell Culture Bioprocess Engineering, 2nd Edition, 2020）

近三十年国际生物医药产业的发展离不开动物细胞培养技术，跨国制药巨头每年数百亿美元的市场销售额离不开动物细胞培养技术的贡献，动物细胞大规模培养技术已当之无愧地成为国际生物医药产业的主流技术、核心技术。我国动物细胞大规模培养技术的研究起始于上世纪80年代，但发展并不顺利，期间有过挫折和停顿。近年国家加大了对生物医药产业的支持力度，我国抗体药物产业迎来了快速发展期。另一方面，我国人口多，人畜禽病毒疫苗产业发展空间巨大，在未来迫切需要提升或更新技术工艺，以提升产品品质和国内外市场竞争力。抗体药物和病毒疫苗等生物医药产业发展的迫切需要，也大力推动了我国动物细胞大规模培养技术的进步和工业化应用。纵观细胞治疗和基因治疗的发展现状，到目前为止虽然全球已获批多款产品上市，包括正在全球范围内开展的大量临床试验，然而动辄几十万美元到上百万美元的治疗费用让人望而却步，因此这些革命性的疾病治疗手段迫切期待技术突破，特别是“过程可描述、环境可调控、质量可保证”的规模化制备工艺以及无血清培养基和智能化生物反应器系统等。

在过去动物细胞培养技术逾百年的发展历程中，除了人工合成培养基诞生、连续细胞系建立、基因重组技术和细胞融合技术等取得突破之外，最具里程碑意义的是个性化高效无血清培养基的开发成功和千升级万升级大规模生物反应器的研制成功，使得动物细胞培养技术进入了无血清、大规模、高密度的新时代。

高密度培养技术及其培养基和反应器是动物细胞大规模培养技术竞争的核心

动物细胞大规模培养技术的工艺表现主要受培养基营养组成、工艺条件和反应器操作参数三个因素的影响。同一个细胞克隆在摇瓶和小型反应器中的代谢、产物表达与大反应器相比差异巨大，在摇瓶和小反应器表现很好的细胞克隆到了大反应器，其表现可能完全相反；同样的，同一细胞克隆在不同工艺操作条件、不同培养基中的生长、代谢和产物表达也常常表现出天囊之别的差异。所有这些变化和差异，究其原因就是细胞所处环境的不同，因此动物细胞大规模培养技术的核心问题就是研究细胞与培养环境的相互作用。

细胞高密度培养是动物细胞大规模培养过程实现目标产物高产率的关键。以动物细胞流加培养过程为例，过去30年的所有工作及其取得的巨大进步主要围绕着4个要素，它们是产物的比生成速率、产物的加工质量、活细胞密度及其维持时间，其中产物比生成速率和活细胞密度与培养时间的积分（IVCC）在过去三十年均提高了数十倍，推动抗体药物的表达量从每升毫克级提高到了每升克级的水平。所以，除了通过基因工程和细胞工程等手段提高产物合成速率之外，培养更高的细胞密度并维持其更长的存活时间，成为了流加培养过程研究和优化追求的主要目标延长。然而高密度细胞培养面临的主要难题是培养过程中必须为细胞提供大量高浓度的营养物质，但营养物质越多浓度越高，细胞生长代谢产生的代谢副产物也会越多，结果不仅会恶化细胞培养环境，而且还会对细胞产生毒性作用，最终抑制细胞生长，导致细胞死亡，因此如何解决营养物耗竭与代谢副产物积累的矛盾一直是高密度细胞培养技术研究、开发和优化面临的挑战，其中不仅需要研究和认识细胞的需要，而且更重要的是必须掌握细胞与培养环境的相互作用，调控细胞的物质能量代谢行为，提高营养物的利用效率，降低甚至消除代谢副产物的生成和积累。

培养基是动物细胞大规模培养技术的重要物质保证。上世纪80年代以前动物细胞培养的培养基中包含的营养物质大概只有二三十种，但现如今的动物细胞无血清培养基组成少则六七十种，多则达到100多种营养物质，组分繁多，包括了葡萄糖、氨基酸、盐、维生素、微量元素等各种营养物质，如何设计、开发和优化高效的无血清培养基组成，事关细胞在培养过程中的生长、代谢和产物的加工、合成、修饰，是实现细胞生长高密度、物质能量代谢高效率、产物表达高产高质的关键所在。以葡萄糖代谢为例，调控细胞进入三羧酸循环，就能大幅度提高葡萄糖的代谢利用率，而且还能从根本上减少甚至完全消除代谢副产物乳酸的生成和积累，一举两得。因此，无血清培养基的设计、开发，基础是认识细胞的“需要”，而关键是调控细胞的“行为”，包括细胞物质能量代谢的行为和产物合成加工的行为。

生物反应器的设计放大和强化优化操作是动物细胞大规模培养技术的根本保障。尽管上世纪80年代开始，国际上开发了各种各样的生物反应器，但目前工业界使用的、能够支持动物细胞实现现今水平大规模高密度培养的生物反应器还是以常规的机械搅拌通气式生物反应器为主。对于此类生物反应器而言，为了支持高密度的细胞生长、代谢和产物加工，必须确保具有足够的流体混合和气液传质能力，就像我们强壮的身体需要有强大的心肺功能作为保障一样。反应器规模放大后，气泡分布、气液物质交换、流体混合等均会受到较大影响，甚至会出现严重的时空不均一性现象。以供氧为例，氧气从气相传递到液相的速率是所有营养物质供给的限制因素，也决定了生物反应器中细胞“饿死时间”的长短，例如我们控制培养环境的溶氧浓度为50%空气饱和度，则培养每毫升1000万个细胞时只需6分钟即可把培养基中的氧气消耗完，而培养细胞的密度达到每毫升6000万个时，饿死时间仅为1分钟不到。因此，反应器一旦搅拌混合不均或者供氧不足，将无法支持细胞生长，更难以达到高密度培养。另外，生物反应器的性能（流体混合和气液传质能力）和参数监测控制系统将直接决定细胞的培养环境，仪表上看到的与细胞实际感受到的经常不一致，这种时空差异不仅会影响细胞生长、代谢，而且还会严重影响细胞表达产物的结构和功能，如糖基化、电荷异质性、片段化等。

未来随着抗体、病毒疫苗等生物医药产业的快速发展和市场竞争的加剧，药物生产工艺将直面更高效率、更低成本的强烈诉求，为此动物细胞大规模培养技术又将面临新的机遇和挑战，人们期待能够构建生长、代谢和产物合成性能更加卓越的细胞，并通过对细胞行为多层次的精准调控实现超高密度的大规模培养技术，同时也希望能够设计制造性能超级强悍、反应灵敏、控制精准的生物反应器系统。未来细胞治疗的兴起以及干细胞和组织工程的发展也是细胞培养技术的新机遇、新挑战，干细胞所处微环境异常复杂，且环境如何调控干细胞扩增和分化及其生理功能仍然知之甚少，现有培养技术和手段离细胞的实际需要仍然相距甚远，三维组织构建过程中的传质限制仍然难以突破，必须寻求新的途径。但不论怎样，认识细胞的需要，设计和优化细胞的培养环境，调控细胞的行为，将依然是细胞培养技术未来发展的不变主题，同时我们期待细胞培养技术在认识生命现象、攻克生物医学难题、生产制造生物医药产品方面发挥更大的作用。

END

责编 | 李秋

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