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作者：

王国强，于茵茵，曾华辉，王旭东，吴玉彬，尚立芝，李玉林，张怡青，张西西，张振强，王云龙

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摘要：

目的:制备热稳定性好,耐RNase攻击及可全程监控操作的核酸检测新型冠状病毒阳性质控品.方法 :分别扩增MS2噬菌体外壳蛋白CP(含PAC位点)基因以及成熟酶蛋白A基因序列(含核糖体结合位点),先后插入质粒pET28a多克隆位点不同位置,构建通用重组载体pET28a/CP-A.合成包含ORFlab基因,N基因和E基因三个靶标的特定核酸序列,插入到重组载体pET28a/CP-A中PAC位点的下游,构建包含靶序列的重组载体pET28a/CP-A/S.通过原核表达系统表达目的蛋白,采用硫酸铵和凝胶过滤层析进行纯化,利用透射电镜和动态光散射对蛋白质进行物理表征.全能核酸酶消化形成的盔甲RNA,通过RT-PCR检测其残余核酸和热稳定性.结果 :成功构建包含MS2噬菌体外壳蛋白CP基因,成熟酶蛋白A基因和外源靶核酸的重组载体,目的蛋白在25℃,IPTG 0.3mmol/L,诱导14h时以可溶性形式得到高效表达,纯化后,得到了大小均一,直径为23-28nm的病毒样颗粒,经核酸酶消化后RT-PCR检测,颗粒溶液中几乎无核酸残余且形成了包封靶基因的盔甲RNA.加速破坏试验表明该盔甲RNA无菌过滤后可在37℃稳定保持10天.结论 :在体外,利用MS2噬菌体外壳蛋白和成熟酶蛋白自组装包封外源靶序列制备的盔甲RNA,其热稳定性好,可全程监控整个检测过程,可作为核酸检测SARS-CoV-2的定性或定量质控品.Nase攻击及可全程监控操作的核酸检测新型冠状病毒阳性质控品.方法:分别扩增MS2噬菌体外壳蛋白CP(含PAC位点)基因以及成熟酶蛋白A基因序列(含核糖体结合位点),先后插入质粒pET28a多克隆位点不同位置,构建通用重组载体pET28a/CP-A.合成包含ORFlab基因,N基因和E基因三个靶标的特定核酸序列,插入到重组载体pET28a/CP-A中PAC位点的下游,构建包含靶序列的重组载体pET28a/CP-A/S.通过原核表达系统表达目的蛋白,采用硫酸铵和凝胶过滤层析进行纯化,利用透射电镜和动态光散射对蛋白质进行物理表征.全能核酸酶消化形成的盔甲RNA,通过RT-PCR检测其残余核酸和热稳定性.结果:成功构建包含MS2噬菌体外壳蛋白CP基因,成熟酶蛋白A基因和外源靶核酸的重组载体,目的蛋白在25℃,IPTG 0.3mmol/L,诱导14h时以可溶性形式得到高效表达,纯化后,得到了大小均一,直径为23-28nm的病毒样颗粒,经核酸酶消化后RT-PCR检测,颗粒溶液中几乎无核酸残余且形成了包封靶基因的盔甲RNA.加速破坏试验表明该盔甲RNA无菌过滤后可在37℃稳定保持10天.结论:在体外,利用MS2噬菌体外壳蛋白和成熟酶蛋白自组装包封外源靶序列制备的盔甲RNA,其热稳定性好,可全程监控整个检测过程,可作为核酸检测SARS-CoV-2的定性或定量质控品.

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DOI：

10.13523/j.cb.2009008

年份：

2020