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一步一步教你使用NCBI查找DNAmRNAcDNA.docx 《一步一步教你使用NCBI查找DNAmRNAcDNA.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《一步一步教你使用NCBI查找DNAmRNAcDNA.docx(20页珍藏版)》请在冰点文库上搜索。 一步一步教你使用NCBI查找DNAmRNAcDNA 一步一步教你使用NCBI查找DNA、mRNA、cDNA、... 最近看到很多战友在论坛上询问如何查询基因序列、如何进行引物设计、如何使用 BLAST进行序列比对……,这些问题在NCBI上都可以方便的找到答案。 现在我就结合我自 己使用NCBI的一些经历(经验)跟大家交流一下BCBI的使用。 希望大家都能发表自己的使 用心得,让我们共同进步! 我分以下几个部分说一下NCBI的使用: Partone如何查找基因序列、mRNA、Promoter Parttwo如何查找连续的mRNA、cDNA、蛋白序列 Partthree运用STS查找已经公布的引物序列 Partfour如何运用BLAST进行序列比对、检验引物特异性
特别感谢本版版主,将这个帖子置顶! 从发帖到现在,很多战友对该帖给与了积极的关注,在此向给我投票的(以及想给我 投票却暂时不能投票的)各位战友表示真诚的感谢,谢谢各位战友! 请大家对以下我发表的内容提出自己的意见。 关于NCBI其他方面的使用也请水平较高 的战友给予补充
Firstofall,还是让我们从查找基因序列开始。
第一部分利用Mapviewer查找基因序列、mRNA序列、 启动子(Promoter)
下面以人的IL6(白细胞介素6)为例讲述一下具体的操作步骤
1.打开Mapviewer页面,网址为: http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/index.html 在search的下拉菜单里选择物种,for后面填写你的目的基因。 操作完毕如图所示: 2.点击“GO”出现如下页面: 3.在步骤二图示的右下角有一个QuickFilter,下面是让你选择的几个复选框,在Gene 前面的小方框里打勾,然后点击Filter.出现下图:
说明一下: 1、染色体的红色区域即为你的目的基因所处位置。 2、下面参考序列给出了 三个,是不同的部门做出来的,经我验证,序列有微小的差异,但总体来说基本相同。 尽管 你分别点击后,序列代码、序列代码等有所差异,但碱基基本一致,不影响大家研究分析序 列。 现在普遍采用的是最上面的那个序列,这一条是世界范围的生物科学家用计算机合成的 一个序列。 我也推荐大家使用这个序列。 4.点击上述三条序列第一条序列(即reference)对应的"Genesseq",出现新的页面, 页面下方为: 5.点击上图出现的“Download/ViewSequence/Evidence”,即下载查看序列等功能, 结果如图所示: 先对上面这张图做点简要的说明,在SequenceFormat(序列输出格式)后面是一个下 拉式选择菜单,默认的为FASTA格式,还有一个是GenBank格式。 我推荐大家选择GenBnak 格式,因为这个格式提供了很多该基因的信息,而FASTA格式只有基因序列。
6.在SequenceFormat后选择GenBank,然后点击下面的Display,目的基因的相关 信息和序列就出现在眼前了。 点击后如图所示(网页较大,只抓取一小部分以作示范): 在上述打开的网页中,你可以看到基因长度,基因序列,以及这个基因是如何被报道出 来的等各种信息。 你会看到: mRNA join(3598..3678,3841..4031,5090..5203,5911..6057,7803..8394) 这代表了从基因的3598位开始就是转录区了,即我们常说的mRNA片断,由于内含子的存在, 所以mRNA在DNA序列上分成了几段。 CDSjoin(3660..3678,3841..4031,5090..5203,5911..6057,7803..7970) CDS代表编码序列,即蛋白编码区是从3660开始的(ATG),由于剪接作用所以CDS区 也是不连续的。
说到这里,可能很多朋友都已经明白了promoter即启动子区域在哪里了。 但我还是再 唠叨几句: 转录起始位点前面是基因的调控区,启动子区没有明显的位置定义,大家也只是 猜测它的大体位置,如果你要研究promoter区的话,建议你选择转录起始位点前的2000 个碱基进行研究,一般默认的是这样。 当然你如果觉得长度太长不好研究的话,也可以只研 究-1000到0这一千个碱基,因为一般情况下,启动子区的变异都在这个区域内。
这样大家就可以找到自己的目的基因序列和启动子了,这种方法可能使用的人不是很 多,但我个人比较喜欢,因为它最大的优点是可以找到启动子区域和其他调控区域。 希望大 家可以发帖交流,让我们把NCBI用的更好!
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第二部分 如何查找连续的mRNA、cDNA、蛋白序列(依 然以人类的IL6为例) 1.进入NCBI主页: http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/ 在search后面选择Gene,在for后面填写需要查找的基因的名字。 如图所示: 出现了很多基因序列,在每个序列的右边还有“OrdercDNAclone”的链接,这些序 列中有些序列是跟你的目的基因同名的,有些是别名(OtherAliases)与你的目的基因一 致,根据每个序列的介绍认真选择你的目的基因。 上图中我需要的IL6是标号为2的序列。
2.1 查找cDNA序列 2.1.1 点击OrdercDNAclone,出现目的页面如图所示: 2.1.2 点击CloneSequence后面的链接即可得到cDNA序列。 点击后如图所示(只抓 取其中一部分) 2.2 查找mRNA、蛋白序列 回到步骤1点击“Go”之后出现的页面,点击目的基因的名字,出现以下页面 (只抓取相关部分): 页面的下半部分,即可以获取mRNA和蛋白序列的部分: 找到“NCBIReferenceSequences(RefSeq)”,它分为几个板块,第一个“mRNAand Protein”区可以让我们找到连续的编码mRNA序列和蛋白序列。 在mRNAandProtein下面有两个序列代码(中间划有一个箭头),这代表了mRNA序列和蛋白序列。 分别点击就可 以得到相应的序列页面。 点击后如图所示,mRNA序列: NCBIReferenceSequences(RefSeq)的第二个板块是Referenceassembly,它下面显示的是Genomic,点击Genomic下面Referenceassembly对应的Genbank或FASTA即可出现编码的DNA序列(注意: 只是编码序列,其中包括内含子,但一般没有5‘非编码区)。 一步就不做贴图演示了吧, 呵呵。 这样我们就可以找到基因的cDNA序列、连续的编码mRNA序列、蛋白序列以及含有内 含子的编码DNA序列了。 相信这些操作对很多战友还是有用的。
如果大家有更好的方法,欢迎发帖交流!
友情提示: 在NCBI里打开的每一个页面都会给我们提供大量的信息,大家不妨好好看 看,可能会有令我们惊喜的收获!
最后唠叨一句: 最近我实验比较忙,只能在深夜发帖,可能要过几天再发第三部分[Part three运用STS查找已经公布的引物序列],希望“期待下集”的朋友可以理解。 第三部分运用STS查找已经公布的引物序列 STS,序列标签位点(SequenceTaggedSite): 一段短的DNA序列(200-500个碱基 对),这种序列在染色体上只出现一次,其位置和碱基顺序都是已知的。 在PCR反应中可以 检测处STS来,STS适宜于作为人类基因组的一种地标,据此可以判定DNA的方向和特定序 列的相对位置。 以上内容基本是STS的定义,我主张活学活用,下面就介绍一下我个人用STS数据库查 找引物的一点经验。 还是使用人的IL6基因为例,呵呵 1.打开NCBI主页,在Search后面的下拉菜单选择UniSTS,在FOR后面填写目的基 因。 操作完毕如图所示
这是你会发现NCBI又提供了很多序列,下面我们还是要初步筛选我们需要的序列。 2.根据物种、目的引物所在染色体的位置等选择相应序列(可能不只一个),点击。 下面以点击第一个进入的画面为例。
你会发现这个页面直接就给出了引物序列,PCR之后的片段长度也是给了的(247bp)。 下面还有很多相关的信息…… 3.点击GeneBankAccession后面的代码,进入下一个页面。
啊! 前后引物都呈现在眼前了,还有反应体系和反应条件! 其中PrimerA是前引物序 列,PrimerB则是后引物序列,并且给出了他们在DNA序列中的位置。 有兴趣的朋友可以 在序列中找一下,是可以找到的,不过要注意,PCR是双链扩增,在序列中可以直接找到 的是PrimerA的原序列和PrimerB的互补序列。
在步骤二里面我只点开了一个序列,继续打开其他的可能还会有对自己有用的引物,不 过这要你自己慢慢发掘了。
这种寻找引物的方法有点投机取巧的味道,实用程度不是很高,但如果这里面恰好有你 想P的片段的话,恭喜你,这些引物都是很成熟的引物,可以直接拿过来使用了。
如果想寻找引物,大家可以查阅相关论文,已经报道的引物我们为什么不用呢? ! 既省 时间,可靠性又强。
如果这两种方法都不能找到你需要的引物的话,那就自己设计吧,建议使用Primer5和 Oligo。 引物设计的详细内容我在这里就不多说了,推荐两个帖子给大家看一下,第一个是 本版版主liuzeyi2002发起的,内容很丰富,很值得学习,另一个则是我发的。
第四部分如何运用BLAST进行序列比对、检验引物特异性 提到序列比对,绝大多数战友都会想到BLAST,但BLAST的使用确实又是一个很大的难 题,因为他的功能比较强悍,里面涉及到的知识比较多,而且比对结束后输出的结果参数(指 标)又很多。 如果把BLAST的使用详细的都讲出来,我想我发帖发到明天也发不完,更何况 我自己也不是完全懂得BLAST的使用。 所以我在这里也就“画龙点睛”——以比对核酸序列 为例来给大家介绍一下BLAST的使用,也算是BLAST的入门课程吧。 请看帖的战友好好体会, 如果你用心看,在看帖完毕之后BLAST的基本使用(包括其他序列的比对)应该没有问题 了。 1.打开BLAST页面,http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/打开后如图所示: 对上面这个页面进行一下必要的介绍:
BLAST的这个页面主体部分(左面)包括了三部分: BLASTAssembledGenomes、Basic BLAST、SpecializedBLAST。 相信大家可以看懂这三个短语的意思,我就不多说了;我要说 的是,可以认为这是三种序列比对的方法,或者说是BLAST的三条途径。
第一部分BLASTAssembledGenomes就是让你选择你要比对的物种,点击相应物种之后即可进入比对页面。
第二部分BasicBLAST包含了5个常用的BLAST,每一个都附有简短的介绍。
第三部分SpecializedBLAST是一些特殊目的的BLAST,如IgBLAST、SNP等等,这个 时候你就需要在SpecializedBLAST部分做出适当的选择了。
总之,这是一个导航页面,它的目的是让你根据自己的比对目的选择相应的BLAST途径。
下面以最基本的核酸序列比对来谈一下BLAST的使用,期间我也会含沙射影的说一下其 他序列比对的方法。 2.点击BasicBLAST部分的nucleotideblast链接到一个新的页面。 打开后如图所 示: 介绍一下上述页面:
EnterQuerySequence部分是让我们输入序列的,你可以直接把序列粘贴进去,也可 以上传序列,还可以选择你要比对的序列的范围(留空就代表要比对你要输入的整个序列)。 JobTitle部分还可以为本次工作命一个名字。
ChooseSearchSet部分是让我们选择要与目的序列比对的物种或序列种类(genome DNA、mRNA等等)。 如果是人或老鼠的话,就可以直接选择了如果是其他物种就要选择 “others”了,这时候网页会主动跳出一个下拉对话框和一个输入式对话框,你可以分别选择和输入要跟你的序列比对的序列种类和物种。 下面的EntrezQuery可以对比对结果进行 适当的限制。
ProgramSelection部分其实是让我们选择本次比对的精确度,种内种间等等。
在BLAST按钮下面有一个“Algorithmparameters”,这是参数设置选项,一般用户 使用不到此项,所以它比较隐蔽,点击,原网页下方即可增加了Algorithmparameters的 内容。 大部分战友都用不到更改这里面的选项,我也不多说了,有兴趣的朋友可以自己研究 一下。 3.依次填写上述网页必须部分,点击BLAST按钮后,出现如下界面(只截取其中一部 分): 出现的这个结果页面信息含量非常大,如果我们用心观察,还是可以发现其中的一些主 要指标的。 列举上图也是为了给大家展示一下这些评价标准。 其中Description部分推荐大 家详细看一下,另外说一下“Evalue”这个指标与其他指标不同,它的数值越小相似程度 越高,其他几个(如Totlescore)都是数值越高相似度越高。
在这个图示的表格下方就是具体的相似性的核酸序列了,还配合着各种参数的得分。
好了,各位亲爱的战友,我的BLAST就发到这里为止了,更具体的东西有待大家一起去 努力研究。 伴随着BLAST的终结,我的“一步一步教你使用NCBI”也要暂时告一段落了, 很高兴自己发第一个帖子时说的话今天终于做到了。 以后如果我有新的NCBI使用方法的话, 我还会添加到这里来,但我想这一阵子是不会接着发了,呵呵。 原始版本下载:
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