图一 MDA反应示意图

1.2、 全基因组DNA直接微量建库方案

MDA能得到高质量的可直接用于建库的DNA，但也有其局限性。第一，MDA对模板的灵敏度极高，提取到的DNA或者在MDA扩增中如果有任何轻微异源污染都会在后续扩增中成倍放大，所以其对整个实验阶段要求极高。第二，目前虽然有95%的覆盖率和高保真性，但和直接提取的DNA仍然有一定的区别。第三，MDA方案对DNA的完整性和纯度有极高的要求；如果完整度和纯度不足，扩增后会存在部分染色体错位或等位基因丢失的现象，这对提取的要求就会很高。通过优化MDA的实验方案能够在一定程度上改善这些问题，但直接将原始DNA用于后续建库测序实验显然是更有效的方案。

根据以往优化实验中积累的大量经验，我们开发了一套派森诺独有的直接以极低起始量DNA为模板进行建库的方案。经过大量实际上机测试，微量建库结果与高起始量的常规建库结果高度一致。

使用相同样品（水稻叶片）同时使用两种方案建库：300ng起始量和5ng起始量建库上机。我们分别从文库质量、下机数据质量、与参考基因组比对率几个方面进行比较两种建库方案。

1.2.1、文库质检

对文库分别用qubit（ng/ul）和qPCR（nM)两种方式定量，使用labchip对文库的大小检测（表一、图二、图三所示）。根据质检结果，两种方案最终文库质量基本一致，文库大小均集中在500bp左右。

表一 文库浓度详表

图二 微量文库labchip检测结果

图三 常规文库labchip检测结果

1.2.2、 下机数据质量比较

将两种文库同时测序，按照6G/样上机，上机模式为Novaseq PE150。分别对两个文库的下机数据进行统计，结果如表二所示。两个文库的下机数据量均在6G以上，N(%)比例、GC含量正常；Q30高，数据可信度高。

Sample：样品名；

Reads Num.：Reads 总数；

Total Bases(bp)：碱基总数；

N(%)：模糊碱基所占百分比；

GC(%)：GC 含量；

Q20(%)：碱基识别准确率在 99%以上的碱基所占百分比；

Q30(%)：碱基识别准确率在 99.9%以上的碱基所占百分比。

表二 测序数据统计

1.2.3、 高质量数据获取

将原始下机数据（raw data）过滤生成高质量序列（high quality data）。数据过滤的基本情况见表三。

Sample：样品名；

Reads Num.：Reads 总数；

Total Bases(bp)：碱基总数；

N(%)：模糊碱基所占百分比；

GC(%)：GC 含量；

Q20(%)：碱基识别准确率在 99%以上的碱基所占百分比；

Q30(%)：碱基识别准确率在 99.9%以上的碱基所占百分比。

表三 测序数据过滤统计

1.2.4、 序列比对

将过滤后得到的高质量数据比对到参考基因组上。序列比对结果统计见表四。

Sample：样本名；

HQ reads：过滤后的高质量 reads 数量；

Mapped reads：比对至参考基因组上的 reads 数量（包括单端比对和双端比对）；

Mapping rate：比对率，比对至参考基因组上的 reads 数量占总 reads 数量的百分比。

表四 序列比对结果统计

根据下机数据结果对比显示，两种方案的文库质量、下机数据质量基本一致，过滤后的高质量数据在参考基因组上的比对率基本一致。除水稻等大型植物外，我们还对动物、微生物、环境等多种不同类型样本进行建库上机测试，微量方案和常规方案在文库质量、下机数据质量等方面都保持一致，在此就不一一赘述~

以上便是派森诺对于低起始量模板的两种建库方案。微量扩增方案对样品和操作环境要求高，需要最大可能避免外源样品的污染，这对取样、提取、建库环节都有着极高的要求。

全基因组DNA直接微量建库优势在于使用了提取后的原始DNA，能保证微量建库结果和正常高起始量建库测序结果一致。返回搜狐，查看更多