从“泰山红”石榴基因组中鉴定出15个SPL基因家族成员。为了便于后续分析，将它们命名为PgSPL1~PgSPL15(表1)．分析了PgSPL成员的蛋白质序列和理化性质。研究结果表明PgSPL基因发生了巨大变化。最短的蛋白质编码162个氨基酸(PgSPL13)，最长为1049个氨基酸(PgSPL9)，分子量为18563.02 ~ 115,942.26 kDa。理论等电点为5.38 ~ 9.39PgSPL13低至5.38PgSPL14高达9.39。含有10种酸性蛋白和5种碱性蛋白。这些结果为PgSPL蛋白的进一步纯化、活性和功能研究提供了理论基础。亚细胞定位结果显示，除PgSPL4，PgSPL6而且PgSPL12在细胞核和细胞质中。

多序列比对结果(图;1)表明，每个SPL转录因子家族成员都含有一个高度保守的SBP结构域，由79个氨基酸残基组成。它们都包含两个锌指结构cys - cys - his (C3H)， Cys-Cys-His-Cys (C2HC)和一个核定位信号(NLS)。的n端锌指结构PgSPL4是Cys4 (C4)，与其他成员不同。

石榴SPL蛋白SBP结构域的多重排列。一个利用DNAMAN软件获得PgSPL蛋白SBP结构域的多个排列。显示了两种保守的锌指结构(Zn-1, Zn-2)和NLS。bPgSPL蛋白SBP结构域的序列标识。每个堆栈中字母的高度表示相应氨基酸的相对频率

系统发育树结果显示15SPL石榴的基因聚为6个亚家族(G1 ~ G6)。2) [42，43］．在这6个亚群中，G1亚群与其他亚群的遗传关系较远，形成了一个相对独立的分支。进一步分析发现，G1亚组的5个成员SBP结构域的n端锌指结构AtSPL7，PgSPL4，VvSPL6，MdSPL17,MdSPL25为C4，而其他子群中所有成员的值为C3H。SPL转录因子家族成员在G3亚组中分布最广。其中，15个石榴中有5个SPL基因分布在G3亚组。G4子组各有一个石榴，拟南芥、苹果和葡萄的SPL基因。有两个PgSPL在G2亚群中有3个基因PgSPLG5和G6基因。

四个物种的系统发育树:石榴，拟南芥，m .释放有而且葡萄

的结果PgSPLs基因结构显示内含子数量为1 ~ 9个(图;3.c). G1和G6的成员包含9个内含子。在G2、G3和G4亚组中，成员除有2个内含子外PgSPL7拥有3个内含子。G5亚群中的PgSPLs仅含有1个内含子。

PgSPL基因家族的系统发育树、保守基序和基因结构。一个根据PgSPL蛋白的全长序列构建了系统发育树。b保守蛋白基序的结构用不同颜色的块表示。c的外显子-内含子结构PgSPL基因

在PgSPLs中鉴定出10个保守基序(图2)。3.b).所有PgSPL蛋白均含有SBP结构域Motif1，该结构域由约79个氨基酸组成。同一亚科的PgSPLs成员具有相似的基因结构和蛋白保护基序。在G2 ~ G5亚群中，所有成员均仅包含SBP结构域，除PgSPL11．然而，G1和G6亚群中的成员在其他亚群中存在一些无结构域或非典型结构域，这些保守基序的分布差异可能是造成基因功能差异的原因。

的独联体-作用元件包含了广泛的变化，从23英寸PgSPL14到42英寸PgSPL7(无花果。4)．PgSPLs对不同的植物激素和非生物胁迫信号有反应，包括AAGAA-motif和ABRE独联体-作用元件涉及脱落酸反应、赤霉素反应元件P-box、茉莉酸甲酯反应元件CGTCA-motif和TGACG-motif，是必需的独联体-调节元件ARE用于厌氧诱导独联体-作用调控元件CAT-box，与分生组织表达相关独联体在光反应性、冷胁迫响应元件LTR、干旱诱导响应元件MBS和常见的独联体-作用元件CAAT-box在启动子和增强子区域。在15PgSPLs11个基因含有AAGAA-motif和ABRE元件，7个基因含有P-box元件，8个基因含有CGTCA-motif和TGACG-motif元件。10个成员包含ARE元素，9个成员包含CAT-box元素，5个基因包含G-Box元素，9个基因包含胁迫相关元素LTR和MBSPgSPL含有CAAT-box增强子的基因。

石榴顺式元素分析SPL基因

许多研究表明，大多数SPL基因受miR156调控，miR156靶位点位于编码区或3'UTR区。为了确定石榴转录后调控机制，在石榴的编码区和3'UTR区寻找miR156靶位点PgSPLs．结果显示PgSPL1，PgSPL2，PgSPL3，PgSPL6，PgSPL7，PgSPL11，PgSPL12，PgSPL13，PgSPL14而且PgSPL15是miR156的潜在靶点，这些基因聚集在G2、G3和G5亚组。的PgSPLs编码区有潜在miR156靶点的基因属于G2和G3，而PgSPL2，PgSPL13而且PgSPL143’utr位点属于G5亚群。PgSPL基因序列与成熟的比较PgmiR156结果表明，PgSPL中超过一半的PgSPL含有互补的序列PgmiR156序列不超过两个不匹配的碱基(图;5)．这一结果与其他物种相似[43，44］．

miR156互补序列的多重比对PgSPL基因

如图所示。6，在不同组织中进行转录组比较分析。结果表明PgSPL1而且PgSPL3在果皮中表达量较高，花中表达量较高，种皮中表达量较低。PgSPL2花中表达量较高，种皮内外表达量中等，而奇妙果皮中表达量不高。差异无统计学意义PgSPL4所有组织的表达水平。PgSPL5两性花I期(3.0 ~ 5.0 mm)、功能雄花I期(3.0 ~ 5.0 mm)和II期(5.1 ~ 13.0 mm)表达量较高，内种皮表达量较低。PgSPL6在外种皮中表达量低。PgSPL7外种皮和两性花II (5.1 ~ 13.0 mm)表达量较高。PgSPL8而且PgSPL9表现出相似的表情模式。PgSPL10在“奇妙”果皮中高度表达。PgSPL11而且PgSPL12并没有在“美妙”的果皮中表达。PgSPL13在叶片中表达量最高，在两性花和功能性雄花的I、II期表达量较高，但在外种皮中表达量较低。PgSPL14功能性雄花I和III的表达量最高。最高水平PgSPL15在叶片中有表达，而在其他组织中低表达或不表达。

的表达热图SPL石榴不同组织中的基因。S1:外种皮;S2:内种皮;S3:果皮;S4;花;S5:根;S6:肉叶;S7:两性花(3.0 ~ 5.0 mm);S8:两性花(5.1 ~ 13.0 mm); S9: Bisexual flowers (13.1 ~ 25.0 mm); S10: Functional male flowers (3.0 ~ 5.0 mm); S11: Functional male flowers (5.1 ~ 13.0 mm); S12: Functional male flowers (13.1 ~ 25.0 mm); S13: Inner seed coat of ‘Tunisia’; S14: Inner seed coat of ‘Baiyushizi’; S15: Mix of leaves, flowers, fruit and roots of ‘Black127’; S16: Mix of leaves, flowers, fruit and roots of ‘nana’; S17: Peels of ‘Wonderful’ (cultivars S1 ~ S6 are ‘Dabenzi’, cultivars S7 ~ S13 are ‘Tunisia’)

我们也验证了miR156a-5p而且PgSPL13在石榴花发育的不同阶段有不同的表达模式(图;7)．研究发现，在两性花的发育过程中(图;7A)，表达miR156a-5p的表达先增加后减少，而PgSPL13先减少后增加。并且在每个时期的表达都有显著差异(p7B)，的表达miR156a-5p的表达显著降低，而PgSPL13显著增加(p

miR156a-5p和PgSPL13石榴花发育的基因。一个miR156a-5p和PgSPL13两性花的基因。BF1、BF2、BF3分别对应两性花3个发育阶段(芽垂径3.0 ~ 5.0 mm、5.1 ~ 13.0 mm、13.0 ~ 20.0 mm)。bmiR156a-5p和PgSPL13功能性雄花的基因。功能雄花MF1、mmf 2、mmf 3分别对应3个发育阶段(花芽垂直直径3.0 ~ 5.0 mm、5.1 ~ 13.0 mm、13.0 ~ 20.0 mm)。柱状图中的竖条为标准误差。每个面板中不同字母的条形图在p根据火鸡的测试

从无花果。6， 8个差异表达PgSPLs筛选基因，得到基因的表达模式PgSPL采用qRT-PCR方法对石榴不同组织中的基因进行分析。结果如图所示。8的表达水平PgSPL2两种花的P7期和P8期表达量最高，两性花P5期表达量显著低于其他期(pPgSPL3两性花P4 ~ P6期显著低于其他期。P6 ~ P8期显著升高(pPgSPL5在功能性雄花中表达量高于两性花，且在两性花发育过程中表达量呈上升-下降-上升趋势。在功能性雄花P2 ~ P4期，基因表达水平明显降低PgSPL5显著增加(pPgSPL6两性花P2期和P5期显著低于其他期(pPgSPL6功能雄花以P8期最高，P4、P7期次之，P6期次之。大量的PgSPL11在两性花P6期均有表达，而在其他阶段均无表达(pPgSPL11均显著高于其他各阶段(pPgSPL12两种花在P2 ~ P4期均较高，且趋势一致。两性花P5、P7和P8期的表达量显著低于其他期(pPgSPL13两性花在发育过程中呈先下降后上升的趋势，功能性雄花则相反。PgSPL13在功能性雄花中表达量高于两性花，在两性花的P8期和功能性雄花的P6期达到最大值。表达水平PgSPL14P3期较高，其他阶段较低。在功能性雄花中，表达水平PgSPL14以P4和P7阶段最高，其次为P2和P5阶段。

的表达PgSPLs在石榴的不同组织中。石榴的花蕾、叶子和茎都是年轻的组织。柱状图中的竖条为标准误差。每个面板中不同字母的条形图在p根据火鸡的测试

从图中也可以看出。8表达水平PgSPL2，PgSPL13而且PgSPL14功能雄花P1 ~ P8期的含量高于两性花。表达水平PgSPL2，PgSPL3，PgSPL6，PgSPL11而且PgSPL14幼叶中显著高于花蕾和茎中(pPgSPL5，PgSPL12而且PgSPL13花蕾中显著高于叶和茎中(p

PgSPL5而且AtSPL8在系统发育树中聚为同一类群，重建的系统发育树也表明PgSPL13在同一根树枝上AtSPL3．研究表明AtSPL8在花药发育过程中起重要作用[36),而AtSPL3在?的发展中起到了非常重要的作用拟南芥花(34，35］．因此，我们推测PgSPL5而且PgSPL13也在石榴花发育中起作用。数字8的表达水平PgSPL5而且PgSPL13花蕾中含量显著高于叶和茎中含量(pPgSPL5引物和PgSPL13引物分别进行PCR扩增。电泳条带与预期靶片段大小一致(图2)。9)．的编码区域序列PgSPL5而且PgSPL13测序得到序列分别为1020 bp和489 bp，分别编码339和162个氨基酸。预测蛋白分子量分别为36911.79 kDa和18563.02 kDa。两个基因都包含一个完整的SBP保守结构域(图。10)．

PCR扩增PgSPL5而且PgSPL13基因。多余的凝胶在图像中裁剪

的编码序列PgSPL5（一个),PgSPL13（b)基因。红框是SBP域

的亚细胞定位PgSPL5而且PgSPL13通过在线工具Cell-PLoc进行预测[45]，发现它们都位于细胞核内。为了验证上述预测结果，我们在烟叶中瞬时表达35S::GFP-PgSPL5和35S::GFP-PgSPL13融合蛋白，并发现这两个基因确实位于细胞核中(图。11)．据推测PgSPL5而且PgSPL13可能与基因表达的调节有关。

PgSPL5和PgSPL13蛋白在烟草叶片中的亚细胞定位

结果表明，适当喷施植物生长调节剂可促进花芽分化，诱导雌花形成，提高植株抗逆性，提高产量。以研究是否表达模式PgSPL5而且PgSPL13基因受不同生长调节剂的影响，通过qRT-PCR分析了不同处理的详细表达模式，不同处理组之间差异较大。

如图所示。12A和b，的表达水平PgSPL56-BA处理下，两种花的P2期表达均显著上调，两性花P7期表达上调但不显著。在两性花的其他发育阶段，表达PgSPL5经外源性6-BA处理后，PgSPL5在功能雄花的P3、P4和P8阶段表达显著下调。表达显著增加PgSPL5在6-BA处理下，叶片和茎部均有显著差异(图;12G)，这种变化在茎中更为明显。PgSPL136-BA处理后两性花P2期表达上调，其余各期均下调。的表达式PgSPL13在6-BA处理下，叶片中显著上调，而在茎中显著下调(图2)。12h)。

表达水平PgSPL5而且PgSPL13在不同的机构接受不同的待遇。a -的表达水平是PgSPL5而且PgSPL13两性花中，功能雄花、叶和茎分别为。图中(B)和(F)分别代表两性花和功能性雄花。柱状图中的竖条为标准误差。每个面板中不同字母的条形图在p根据火鸡的测试

经IBA处理后(图;12C, d)，我们发现的表达式PgSPL5在两性花的P3和P8期表达下调，在两性花的其他发育阶段表达上调，其中P2期表达上调最为显著。在功能性雄花P2和P5期，基因表达水平PgSPL5IBA处理显著上调，其他阶段显著下调。在叶和茎中，表达PgSPL5IBA处理与6-BA处理有相同的变化，但这种变化不如6-BA处理明显。PgSPL13在两性花的P2、P5期和功能性雄花的P2、P4期均显著上调，而在花的其他发育阶段均显著下调。类似地，的表达式PgSPL13IBA处理与6-BA处理叶片和茎的变化相同。

从Fig可以看出。12E和f的表达式PgSPL5而且PgSPL13喷施外源PP333后，在功能雄花P2期表达显著上调，而在花发育的其他阶段均被抑制。PgSPL5在叶和茎中表达上调，而PgSPL13在叶片中表达上调，在茎中表达下调。这与6-BA和IBA处理中观察到的趋势一致。