|过程

1. scRNA-seq 分析突出了 iCAF 在 BCa 中的作用

如图 1A 所示，根据标记 COL1A1，确定了十个簇，其中两个簇被注释为 CAF。 我们根据先前报告的标记（PDGFRA 和 RGS5）进一步确定了 iCAF（cluster4）和 mCAF（cluster7）（图 1A）。热图显示，免疫和炎症调节剂 CXCL14 在 iCAF 中上调，而收缩蛋白（TAGLN 和 MYL9）在 mCAF 中过表达（图 1B）。富集分析表明，iCAF 与细胞外基质组织和上皮细胞增殖有关，而平滑肌细胞的粘着斑和调节主要在 mCAF 中富集（图 1C）。此外，GSEA 证明上皮-间质转化和肌生成标志分别在 iCAF和 mCAF中上调 （图 1D）。

▲ 图1

不出所料，生存分析显示了 iCAF 在 BCa 中的预后作用（图 S2A）。此外，iCAFs 亚型与高龄、晚期（III 期和 IV 期）、血管淋巴浸润和囊外扩展等性状有关（图 S2B）。 总的来说，iCAF与mCAF 中，前者与 BCa 患者的进展和不良预后更加相关。因此，本研究将进一步探讨 iCAF 和其细胞标志物的生物学作用。

2. iCAF 相关特征主导 BCa 的炎症和免疫抑制 TME

为了阐明 iCAF 在塑造 TME 中的关键作用，我们通过几种已发表的方法对 TME 分析。首先，基于 28 个免疫相关特征的富集活动，通过无监督层次聚类确定了三种免疫亚型并将其定义为高、中、低免疫亚型（图 S3A）。高免疫亚型与高免疫、基质和 ESTIMATE 评分以及低肿瘤纯度相关（图 S3B）。在高免疫亚型中发现了 CD8+ T 细胞和 CD4+ T 细胞的高浸润水平。令人惊讶的是，M1 和 M2 巨噬细胞在该亚型中也高度浸润，这体现了 BCa 中 TME 的异质性和复杂性（图 S3C）。iCAF 相关特征在高免疫亚型中上调（图 S3A、B），iCAF 签名评分从高免疫亚型到低免疫亚型 逐渐降低（图 S3B）。本研究通过以上结果 推测，iCAF 在 BCa 中形成了促肿瘤表型的炎症 TME。先前的研究结果表明，由于错综复杂的免疫抑制信号网络，大量浸润的 CD8+ T 细胞在 TME 中被称为“耗尽”[9]。耗尽亚型的特征是过度表达的抑制受体和较差的效应子功能。因此，我们进一步探讨了耗尽的 T 细胞与 iCAF 之间的相关性，并发现了强烈的正相关性（图 S3D）。为了验证有趣的发现，我们通过执行其他三种方法进一步对 TME 进行了去卷积，包括 quanTIseq、TIMER 和 MCPcounter。一致地，CD8+ T 细胞、Treg 和 M2 巨噬细胞在 BCa 的 TME 中高度浸润，具有高 CAF 相关评分（图 S3E）。综上所述，我们推测 iCAF 主导了 BCa 的促肿瘤炎症和免疫抑制 TME。

▲ 图S3

3. iCAF 相关签名将 BCa 分层为具有不同生物学特征的分子亚型

基于 iCAF 相关特征， 使用无监督共识聚类鉴定出了TCGA-BLCA 的两种分子亚型（图 2A）。分型 2 与 分型1 表现出色的辨别力，iCAF 相关分数明显更高（图 2B，C）。随后的 结果显示，iCAF 相关亚型具有不同的免疫基因组模式。如图 2D所示， 分型2 的大部分与中/高免疫亚组相关，而 分型1 的特点是低免疫亚组。进一步分析 TME 可以发现， 分型2 具有高免疫/基质/估计评分和低肿瘤纯度（图 2E）。此外，M2 巨噬细胞在 分型2 中高度浸润，而树突状细胞和幼稚 CD4+ T 细胞在 分型1 中高度浸润（图 2F）。

Zhang等人先前的研究以泛癌方式全面分析了 T 细胞耗竭异质性，并确定了五个具有不同功能特性的耗竭 T 细胞亚群。他们提出了 TEX 特征的三个基因（RBM10、AXIN2 和 MSI2），后者在终末分化亚型中高度表达。我们分析这三个特异性标记物在亚型间的表达水平，发现它们在 分型2中高度表达（图 2G）。 M2 极化因子在 分型2中也大多被上调（图 2H）。 总之， 分型2可能表示 BCa 的免疫抑制性 TME。

▲ 图2

4. iCAF 相关亚型具有明显的失调通路

与 分型1相比， 分型2的预后较差，基底/鳞状和管腔浸润亚型的比例较高，管腔和管腔乳头状亚型的比例较低（图 3A，B）。此外，大多数与干性相关的特征在簇 2 中被上调（图 3C）。然后，本研究在分子亚型中研究了癌症失调的标志。结果显示， 分型2与上调的 EMT、TNF-α/NF-κB 通路和 IL-6/JAK/STAT3 信号转导有关（图 3D）。GSEA 显示 分型2与趋化因子信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、JAK/STAT 和 PI3K/AKT 信号通路相关（图 3E）。

不仅如此，iCAF 相关亚型对免疫疗法和化疗有不同的反应。分型2 对抗 PD1 疗法不太敏感（图 3F）。此外， 分型2 对六种化疗药物的敏感性也较低，包括顺铂、多柔比星、吉西他滨、甲氨蝶呤、紫杉醇和长春碱，这些药物常用于泌尿外科（图 S4）。

▲ 图3

5. iCAF 相关亚型在外部 GEO 数据集中表现出稳健性

为了验证这些发现，将具有来自 GEO 数据库临床信息的 519 名患者的七个独立 BCa 数据集标准化为meta队列（图 S5A）。确定了两个 分型（图 S5B）， 分型1主要分为中/高免疫组（图 S5C）。 iCAF 和 TEX 之间的正相关证实了 iCAF 在发炎的 TME 中的免疫抑制作用（图 S5D）。此外，M2 极化因子在 分型1 中过表达（图 S5E）。 与之前的发现一致，iCAF 相关亚型预测了 BCa 存活和分子亚型（图 S5F，G）。通路分析表明， 分型1 的上调基因主要参与细胞因子调节、炎症和免疫调节（图 S5H）。 最终，评估了 iCAF 相关亚型对治疗预测性能的反应。结果显示， 分型2 的特点是对抗 PD1 治疗和化疗更敏感（图 S5I、J）。

▲ 图S5

6. iCAF 相关亚型预测 ICI 治疗队列的预后和免疫治疗反应

通过无监督共识聚类，IMvigor210 队列根据 iCAF 相关特征分为两种分子亚型。与 分型 2 相比，具有较高 iCAF 相关特征评分的分型 1 预示着较差的预后和较低的免疫治疗反应率（图 4A-C）。此外，肿瘤突变负荷 (TMB) 是免疫治疗反应的预测因子，在 分型1中明显较低（图 4D）。

▲ 图4

7. LOXL2+ iCAFs 预测不良预后

通过 PPI 网络分析，LOXL2 被确定为 iCAF 相关特征的中心基因（图 5A）。Pearson 相关分析表明， LOXL2 与 iCAF 相关评分之间存在显著正相关（图 5A）。此外，LOXL2 的过表达预示着不利的预后（图 5B）。功能分析表明，LOXL2 过表达与预示着 高浸润水平的M2 巨噬细胞（图 5C）。此外，高表达的 LOXL2 将预测几种免疫疗法途径的富集评分较低（图 5D）。

考虑到 iCAF 的异质性，我们对 iCAF 进行了重新聚类并成功识别了三个亚群。LOXL2 在簇 2 中完全过表达，这与预后不良有关（图 5E，G）。伪时间分析表明，cluster0 被投射到根上，而cluster1 和 cluster 2 分别被投射到两个分支上（图 5F），并且LOXL2 表达水平随轨迹树显著变化（图 5H）。有趣的是，我们发现分支点1 充当调节分化和基因表达谱的“检查点”。因此，我们进行了 BEAM 分析来识别分支依赖性基因。结果表明，包括 CXCL13、LOXL2、C7 和 APOD 在内的模块与 iCAF 中cluster2 的发展方向呈正相关（图 5I）。因此，我们将 cluster2命名为“LOXL2+ iCAFs” 。

▲ 图5

8. CAF中上调的LOXL2促进了BCa细胞的增殖、迁移和转移

我们发现，与正常组相比，LOXL2 在 CAF 中被内源性上调（图 6A）。 为了研究 LOXL2 的生物学作用，本研究分别通过质粒和 siRNA 进行过表达与沉默，并通过 qRT-PCR 和 WB 测定验证了效果（图 6B 和图 S7A）。

结果显示 ，LOXL2 在 CAF 中的过表达促进 增殖（图 6C 和图 S7B）、迁移（图 6D 和图 S7C）和侵袭（图 6E 和图 S7D），而 LOXL2 的沉默抑制。 考虑到由 LOXL2+ iCAF 主导的免疫抑制性 TME，我们评估了 M2 的标记 CD206 在具有条件 LOXL2 的 CAFs-CM 中的表达。WB分析表明，LOXL2 的耗尽显著降低了 CD206 蛋白水平（图 6F）。相反，加强的 LOXL2 表达增加了其蛋白水平（图 6F）。

▲ 图6

为了弄清楚 LOXL2 过表达/沉默成纤维细胞调节 T24 细胞的机制，在 CAF 中 LOXL2 敲低后处理 RNA-seq（图 6G）。IL32 被确定为 DEG 中唯一的可溶性因子（图 6G，H）。GSEA 显示细胞因子-细胞因子受体相互作用在 LOXL2 敲低的 DEGs 中富集（图 6I）。此外，在线工具 GEPIA 显示 LOXL2 和 IL32 之间呈正相关（图 6J）。ELISA 显示 IL32 受 LOXL2 正向调节（图 6K 和图 S7E）。然后进行表型测定以研究 LOXL2 和 IL32 之间的功能关系。CCK-8 测定显示抗 IL32 抑制由 LOXL2 过表达 CAF 衍生的 CM 诱导的 BCa 细胞增殖（图 6C）。在伤口愈合（图 6D）和 transwell 实验（图 6E）中也发现了类似的趋势。rescue实验表明 IL32 可以恢复 LOXL2 敲低抑制的 BCa 细胞的增殖、迁移和侵袭特性（图 S7B-D）。总的来说，CAF 可能通过 LOXL2-IL32 轴促进 BCa 细胞发育。

▲ 图S7

|总结

通过整合单细胞测序和 bulk RNA-seq 分析，我们确定了一个 iCAF 相关特征，该特征将 BCa 患者分为具有不同分子特征的两个亚型。该特征在预测 TCGA-BLCA、GEO-meta 和三个 ICI 治疗队列中的免疫疗法/化疗的预后方面表现出稳健性。随后的分析确定了不良预后、免疫反应受损和 M2 浸润的中枢基因 LOXL2。此外，LOXL2 在一个名为“LOXL2+ iCAFs”的 iCAFs 亚群中被完全上调。此外，体外共培养实验验证了 LOXL2-IL32 轴在调节膀胱癌细胞增殖、迁移和侵袭能力中的作用。至此，LOXL2 可作为 BCa 治疗的有希望的靶标。

单细胞鉴定marker

转录组进行分型与评价

PPI筛选marker中的核心基因

再重新依据核心基因细分细胞亚群

实验做了验证和下游

一个月见刊

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