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作者：

闫啸

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摘要：

GroEL是分子伴侣体系中研究最为深入的一种,它与辅助伴侣GroES一起在ATP作用下形成大分子空腔—Anfinsen cage,为蛋白质折叠提供合适的微环境.然而,GroEL强制依赖型底物多具有复杂的拓扑结构,其机理还不甚清楚.重组人γ干扰素(rhIFN-γ)是一种具有重要药用价值的蛋白质,因为结构特殊,rhIFN-γ在大肠杆菌(E.coli)中表达时主要以没有生物活性的包涵体形式存在.本文研究藉助GroEL体系促进rhIFN-γ在E. coli中的可溶表达,并探讨GroEL介导下的rhIFN-γ折叠与组装途径. 首先将rhIFN-γ基因克隆到质粒pET-28a上,构建了rhIFN-γ表达质粒pET-IFN-γ.将pET-IFN-γ质粒和编码伴侣蛋白GroEL/GroES的pGro7质粒共转化入E. coli BL21中,获得了分子伴侣GroEL/GroES与rhIFN-γ共表达体系. 通过对共表达体系的发酵条件包括培养温度和诱导剂浓度等进行优化,实现了rhIFN-γ的可溶表达.结果表明,在低温下GroEL/GroES系统能够有效促进rhIFN-γ的可溶表达,而且rhIFN-γ上清和沉淀的比值与GroEL表达水平呈现出显著的正相关性.优化后的培养条件为:种子液以1%接种量转接入2×YT培养基,同时以0.5g/L的L-阿拉伯糖(L-arabinose)诱导GroEL/GroES表达;在对数生长期OD600为0.6时加入0.2mM的IPTG诱导rhIFN-γ,诱导后在25℃,180rpm的条件下培养8h收获菌体.优化后可溶rhIFN-γ表达量与对照组相比提高了约2.2倍. 菌体破碎离心后,将上清液经镍柱亲和层析纯化.借助一系列结构表征手段,发现可溶rhIFN-γ在二级结构(圆二色谱),三级结构(荧光光谱)和四级结构(体积排阻层析和DSS化学交联)上都与天然rhIFN-γ一致.采用酶联免疫吸附法(ELISA)进行免疫反应性分析,每升发酵液可以获得72.91mg活性rhIFN-γ,表明应用共表达GroEL/GroES系统生产rhIFN-γ具有潜在的应用前景. 最后,探讨了GroEL/GroES介导下的rhIFN-γ折叠与组装途径.采用酵母双杂交系统鉴定了rhIFN-γ与伴侣蛋白的相互作用,发现GroEL和GroES都与rhIFN-γ存在较强的相互作用,从而促进其可溶表达.进一步,通过共表达其它分子伴侣(trigger factor和Dnak系统),证实了rhlFN-γ必须依靠GroEL/GroES才能实现正确折叠,即为GroEL强制依赖型(Class Ⅲ)底物.综合rhIFN-γ的结构特点及折叠途径,提出了GroEL系统针对寡聚蛋白组装的"构象维护功能"(conformational maintenance),并采用分子动力学模拟方法(ZDOCK, RDOCK和CHARMm等)初步阐明了氢键,离子键和疏水相互作用能够为"构象维护"提供一定的支撑.

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关键词：

伴侣蛋白GroEL/GroES 重组人γ干扰素 共表达 可溶表达 蛋白质折叠 结构表征 蛋白-蛋白相互作用 分子动力学

学位级别：

硕士

学位年度：

2012

被引量：

6