剑神的左手 2023-02-03 11:31:46

作者：Karry

0

题记

一般来说，做通路机制问题属于性价比不太高的研究，但是为了更好地说明问题、证明观点，往往需要一些分子机制研究，因此，十分必要了解一些经典的通路研究方法。

这次分享的就是一篇非常全面地肿瘤糖代谢研究，发表在Cancer Cell (IF=27)，MUC1 and HIF-1alpha Signaling Crosstalk Induces Anabolic Glucose Metabolism to Impart Gemcitabine Resistance to Pancreatic Cancer。（回复170901可下载，一周有效）

以往研究表明：

1）癌症组织内会发生明显的代谢改变，低氧会导致HIF-1α水平升高，进一步增加肿瘤细胞对糖的摄取。

2）而肿瘤细胞内糖的增加不仅会导致糖酵解途径增强，同时增加生物合成。

3）低氧也是许多肿瘤，包括胰腺癌，对治疗产生耐受的重要原因。

4）而大部分肿瘤耐药研究认为耐药性的产生是由于肿瘤细胞内药物内流与外排比例降低导致的。

但是，这篇文章则证明了HIF-1α引起糖酵解途径增加和嘧啶合成增加，是胰腺癌对吉西他滨产生耐药的机制，靶向作用于HIF-1α能够增加吉西他滨的有效性。文章提出了新的肿瘤耐药机制。

文章研究的思路主要是，通过体外细胞实验→动物体内实验→人体标本/临床随访，寻找肿瘤耐药机制糖代谢变化的情况、原因（上游）、后果（下游），并证明对上游的阻断可以改善肿瘤耐药。

1

胰腺癌细胞吉西他滨耐药是由于糖代谢增加导致

吉西他滨耐药的胰腺癌细胞（以下称为Gem-R细胞，由胰腺癌细胞系Capan-1, T3M4, MIA PaCa-2分别经吉西他滨处理获得），Gem-R细胞在正常氧浓度和低氧浓度下，都表现出糖摄取增加（[3H]-2-deoxyglucose）、乳酸释放增加，且糖代谢相关基因表达水平（mRNA）都增加。通过LC-MS/MS串联质谱分析，发现Gem-R细胞内糖酵解中间代谢产物增加。（图F和G）

进一步证明胰腺癌细胞产生吉西他滨耐药是由于上述观察到的Gem-R细胞内糖代谢的变化导致的？细胞外低糖环境下，Gem-R细胞存活减少（图H）；Gem-R细胞外酸化率（ECAR）增加和氧消耗率（OCR）减少（图I和J）。

使用流式细胞术根据葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）表达高低将Gem-R细胞分为两组，发现GLUT1表达低的Gem-R细胞对吉西他滨敏感性强于GLUT1表达高的Gem-R细胞。

体内实验，裸鼠原位抑制Gem-R细胞，18F-FDG PET/CT发现Gem-R细胞糖摄取明显高于野生型（图L）；对接受氟尿嘧啶类似物（吉西他滨或者5-FU）治疗的胰腺癌患者进行18F-FDG PET/CT，发现18F-FDG摄取较高的患者，其用药情况下无进展存活期较差（图M）。

综上，研究者证明了吉西他滨耐药细胞依赖于糖代谢改变。默默觉得只有这些实验也能发表一篇相当好的文章了。研究者接下来对糖代谢改变进行了上下游的研究。

2

Gem-R细胞内葡萄糖增加通过非氧化磷酸戊糖途径

通过LC-MS/MS串联质谱分析，发现糖代谢增加主要通过非氧化的磷酸戊糖途径（PPP，图A和B）；与非氧化PPP相关的基因表达水平增加（图C）。

为了进一步确定非氧化PPP对糖代谢增加的作用，通过1-14C-葡萄糖（氧化PPP和三羧酸循环释放）和6-14C-葡萄糖（只通过三羧酸循环释放）的摄取比例检测，发现Gem-R细胞内二者比例降低，提示非氧化PPP途径增加（图D）。

进一步通过U-13C-葡萄糖标记PPP代谢产物，发现Gem-R细胞内葡萄糖进入糖酵解途径更快（G6P/F6P/FBP），而进入氧化PPP途径变慢（6PGL）。

至此完成了Gem-R细胞内葡萄糖代谢途径改变下游比较完整的研究。

3

Gem-R细胞内嘧啶合成增加也与吉西他滨耐药有关

LC-MS/MS串联质谱分析以及后续的代谢通路和功能富集分析发现嘧啶合成通路是Gem-R细胞内最显著变化的通路之一（图A），嘧啶合成中间代谢产物增加（图B），嘧啶合成相关基因表达水平增加（图C），说明在Gem-R细胞内嘧啶合成增加。

来氟米特（乳清酸脱氢酶抑制剂，抑制嘧啶合成）和吉西他滨，能够明显减少Gem-R细胞存活，减少裸鼠肿瘤体积，降低细胞增殖情况（图E-G）。说明嘧啶合成增加也参与了吉西他滨耐药过程。

4

Gem-R细胞内脱氧胞嘧啶增加降低了吉西他滨治疗有效性

Gem-R细胞内所有核苷酸水平均升高（A），培养基中加入脱氧胞嘧啶能够明显增加Gem-R细胞存活，而增加其他种类脱氧核苷酸没有明显的增加细胞存活的作用（B和C）。而且，对胰腺癌病人快速冰冻组织检测发现，高浓度脱氧胞嘧啶的患者存活时间短于低浓度脱氧胞嘧啶患者（F）。

5

HIF-1α是调节Gem-R细胞糖代谢增强和嘧啶合成增加的主要分子

Gem-R细胞在正常氧浓度和低氧情况下，HIF-1α和其调控的蛋白表达水平均增加（A）；敲除HIF-1α和HIF-2α之后，WT和Gem-R细胞内糖摄取和细胞存活均下降（B-D），HIF-1α敲除后更明显。

同样可见于其他非吉西他滨耐药的胰腺癌细胞系（PANC-1，MIA PaCa-2，图E-G）；Gem-R细胞内敲除HIF-1α后，细胞对吉西他滨敏感性增加（H）。低氧诱导Gem-R细胞内HIF-1α表达增加，或者加入地高辛抑制HIF-1α翻译，发现HIF-1α能够增加CTPS1和TKT的表达（图I）。

裸鼠种植瘤组织内观察到CTPS和TKT与EF5（低氧标志物）共定位，与CA IX（HIF-1α活性标志物）共定位，患者胰腺癌组织中也观察到CTPS和TKT与CA IX共定位。

这些结果都说明了HIF-1α通过调节CTPS1和TKT表达介导了胰腺癌细胞的吉西他滨耐药性。

6

靶向作用于HIF-1α能够增强胰腺癌细胞对吉西他滨的敏感性

使用地高辛（HIF-1α抑制剂）或者敲除Gem-R细胞内HIF-1α后，把上面的实验全部重复一遍，包括细胞内脱氧胞嘧啶水平、细胞存活、裸鼠原位种植瘤的体积、种植瘤内细胞增殖情况（Ki-67染色阳性）。

结果发现抑制HIF-1α或者敲除HIF-1α之后，能够增强胰腺癌细胞对吉西他滨的敏感性。

其实研究者还进行了MUC1的研究，CTPS和TKT水平下降对吉西他滨敏感性的影响，在此不多做介绍。看起来非常复杂的通路研究，其实内在的逻辑很简单。

欢迎投稿

[email protected]

合作helixlife6

免责声明：本文仅代表文章作者的个人观点，与本站无关。其原创性、真实性以及文中陈述文字和内容未经本站证实，对本文以及其中全部或者部分内容文字的真实性、完整性和原创性本站不作任何保证或承诺，请读者仅作参考，并自行核实相关内容。