1. 前言

细胞外基质（ECM）是由体内各种组织和细胞合成和分泌的大分子物质组成的复杂网络，如成纤维细胞、间充质细胞和上皮细胞，它们分布和聚集在细胞表面和细胞间物质上。ECM形成组织和器官的细胞骨架，支持和连接组织结构，调节组织发育，并形成细胞生长所需的微环境。ECM对细胞行为有重大影响，包括粘附、分化、增殖、迁移和功能表达。ECM在组织发育、体内稳态和疾病中发挥重要作用。在某些疾病中，由于严重损伤，必须更换组织或器官。然而，供体来源不足和移植后的排斥反应限制了这种治疗的应用。研究ECM在各种组织中的组成和功能以及具有高仿生性能的生物支架的模仿和构建已成为组织工程领域的重要领域。水凝胶可以模拟人体组织的水环境，具有良好的生物相容性，可以与细胞交换营养物质、氧气和废物。目前，水凝胶是组织工程的理想生物材料。Badylak等人的研究表明，脱细胞生物支架在物种之间具有良好的保护性，并且被异质宿主很好地耐受，从而有效地减少免疫排斥并促进结构重塑。通过物理、化学和酶法等脱细胞方法获得的天然组织的脱细胞支架被冷冻干燥、研磨，并被酶消化以形成脱细胞基质（dECM）水凝胶，其保留水凝胶响应性的结构特征和刺激特性。ECM生物支架形成水凝胶方法的开发进展扩大了水凝胶在体外、体内和临床实践中的潜在应用。本文综述了水凝胶的类型、dECM水凝胶的历史和形成、dECM的来源、dECM在组织工程中的应用、dECM材料的商业应用以及该领域的未来前景。

2. dECM水凝胶

理想的生物活性水凝胶支架的性质应与天然组织ECM的结构和生物学性质相似。目前的生物活性聚合物水凝胶在模拟ECM的各种生物功能和机械性能方面受到限制。脱细胞基质是通过去除细胞成分从组织或器官制备的天然支架，并保留组织或器官的三维结构和一些天然纤维成分，如胶原纤维；该支架具有生物活性、生物相容性和非免疫原性。dECM水凝胶保留了许多细胞生长因子，如成纤维细胞生长因子、转化生长因子和肝细胞生长因子等，它们可以增强种子细胞的生长、迁移、增殖、分化和血管生成。这种与种子细胞的“实时互动”可以重塑组织和器官的结构，对组织和器官再生和功能修复至关重要。

2.1 dECM水凝胶的历史

在临床和临床前研究中，由细胞外基质（ECM）组成的生物支架已被用于促进各种组织的修复和重建。这种支架的临床应用可能受到收获ECM的组织或器官的几何和机械性质的限制。ECM的可注射凝胶形式可能符合任何三维形状，并且可以通过微创技术将其输送到感兴趣的部位。因此，脱细胞技术的逐步进步和脱细胞基质（dECM）形成水凝胶的能力的提高导致了dECM水凝胶在组织工程和再生医学中的创新应用。在Badylak及其同事于2008年报道了猪膀胱脱细胞基质水凝胶的制备之后，心脏、肾脏、肝脏、胰腺、食管、小肠粘膜下层（SIS）、半月板、神经、脂肪和其他组织已经脱细胞和凝胶化。因此，dECM水凝胶在临床上具有广阔的应用前景。

2.2 dECM水凝胶形成

ECM衍生的生物支架是组织的天然成分，已脱细胞以保持原始组织固有的结构和化学完整性。脱细胞基质水凝胶的形成基于胶原自组装，并受糖胺聚糖、蛋白聚糖和各种蛋白质的影响。通常，脱细胞的生物ECM支架被冷冻干燥并研磨成粉末，将其消化并以一定比例溶解在酸性蛋白酶的酸性溶液中，以制备均匀的溶液。然后，改变溶液温度、盐离子浓度和pH值，或添加交联剂以诱导交联形成凝胶。Freytes等人通过冷冻干燥、研磨、溶液中的盐酸胃蛋白酶消化和磁力搅拌制备了猪膀胱dECM溶液，并用氢氧化钠将猪膀胱dEM溶液的pH调节至中性（pH≈7.4）。改变溶液中的盐离子浓度以形成预凝胶，通过加热至37°C形成水凝胶。最近，Badylak及其同事提出了一种利用超声空化制备ECM水凝胶的新方法。粉碎的ECM用作起始材料；将ECM重新悬浮在中性缓冲盐溶液中，并通过20kHz的超声处理溶解。ECM溶液的温度降至25°C以下，以诱导快速凝胶化。dECM溶液的预凝胶化是形成dECM水凝胶的关键步骤。临床医生可以将dECM预凝胶注射到手术部位。在人体温度（37°C）下，dECM预凝胶可以快速形成dECM水凝胶。

2.3 dECM来源

2.3.1. 细胞来源细胞衍生基质（CDM）包含复杂且有组织的大分子混合物，可模拟自然组织微环境的所有方面。原代细胞和细胞系都已用于生产CDM。未经传代直接从组织中收获的原代细胞通常被认为是组织工程和生物医学应用的理想细胞来源，因为它们与它们的天然体内表型非常相似，可以说产生的基质容量与天然微环境更相似。间充质干细胞是容易获得的细胞，通常用于制备细胞衍生ECM，因为它们能够根据培养条件沉积模拟各种组织（如骨、软骨、脂肪）的ECM，以及它们在组织工程中的应用。细胞衍生的dECM的主要缺点之一是CDM通常具有较差的机械性能。

2.3.2. 动物来源自体和同种异体组织的来源极其有限。异种移植仍然是克服人类组织短缺的合适解决方案。异种组织的无细胞细胞外基质已成为当今组织修复技术研究的主要主题。不同动物的各种组织已被广泛用于制造dECM，如猪的膀胱和心脏、牛的肌腱[63]、山羊的肺和肾以及大鼠的肝和肺。非均质DECM的主要来源是猪。猪组织和器官的使用在许多方面优于其他动物组织和器官。与其他动物相比，猪的器官很容易获得，数量也更大。由于其高繁殖能力和大量后代，猪一直是提供组织和器官的DECM的首选，但人类感染猪内源性逆转录病毒（PERV）的风险是不可避免的。此外，源组织的差异可能会影响dECM的组成、降解速率和机械性能。

2.3.3. 人类来源为了避免疾病从动物身上传播，并且从动物身获得的异种dECM可能含有残余污染和免疫原性，人类组织将是临床应用dECM的最佳选择。人类衍生的dECM可从尸体、患者患病或受损的组织和器官以及从人类组织生物库捐赠的组织中获得。来自人体的各种组织和器官已被用于制造dECM。例如，整个心脏、软骨、卵巢组织、脂肪组织、胰腺、肾脏、肝脏、皮肤、牙齿和肺已成功脱细胞。

3. dECM水凝胶在组织工程中的应用

dECM水凝胶具有以下优点。（1）可注射性。粘性液体预凝胶可以用导管或注射器注射，并在生理温度下聚合，形成符合缺陷部位形状的水凝胶。（2） dECM水凝胶具有天然基质的固有生物活性。（3） dECM水凝胶不含免疫原性细胞材料。（4）机械性能的可调节性。dECM的机械性能可以通过改变水凝胶的浓度或通过交联来控制。（5）凝胶dECM具有适合细胞生长的三维结构。（6） dECM水凝胶是可修饰的，可以支持细胞、治疗药物或其他生物活性分子。（7） dECM水凝胶的可加工性。3D几何形状可以通过3D打印进行定制。因此，dECM广泛用于体外和体内应用，如下图1所示：

图1 dECM水凝胶在组织工程中的应用

3.1 dECM水凝胶的体外应用

源自脱细胞组织的ECM水凝胶可用于体外血管网络重建，并作为体外细胞培养系统、生物墨水和类器官衍生物的基质，为细胞提供指导。生长环境维持并增强组织特异性细胞表型，诱导谱系定向祖细胞的趋化性，并调节细胞增殖和分化。

3.1.1. 细胞培养系统的基质

细胞行为的研究一直是一个挑战。当细胞从组织的3D环境中移除时，它们与ECM和基底膜失去接触，并改变其行为。因此，密切关注3D培养系统的优化，以模拟细胞在体内可能经历的过程。一些研究使用人肾小球内皮细胞（GEnCs）作为模型细胞类型来研究细胞与肾脏dECM水凝胶的相互作用。GEnC系来源于从肾小球分离的内皮细胞。与原代细胞在培养物中难以扩展并随时间失去重要表型特征不同，条件永生化的GEnCs在适当的温度下培养。它们的扩张可以保持；然而，转移到不合适的温度会阻止膨胀并开始逐渐成熟。体外研究表明，肾脏dECM水凝胶可以用作生物相容性基质，以支持人GEnCs的附着、存活和增殖。这些水凝胶是在温和的条件和生理温度下形成的；因此，它们可以用于细胞封装。在肾脏dECM水凝胶（2.5 mg/mL）中包封后，人GEnCs具有较高的生存能力。Matrigel已被证明是维持分化基因表达和功能最有效的培养基。基质胶是一种来源于EHS小鼠肉瘤的基底膜基质。源自猪肝的ECM凝胶形式在体外支持人肝细胞功能，其水平与Matrigel相当。这些研究表明，dECM水凝胶可以用作理想的3D培养系统，以创建能够引导细胞生长并调节细胞增殖和分化的环境。

3.1.2. 胆管树的体外重建

胆管树是可移植人肝组织的重要组成部分。其精细分支复杂，结构和功能各异。它们不能人工培育，只能通过先天发育再生。发育中的肝脏的细胞外基质（ECM）在胆管树的形成和成熟中起着不可或缺的作用。原代胆管细胞具有一定程度的体外形态发生以生成胆管细胞。胆管细胞（SV40SM44）可以封装在肝脏dECM凝胶中。它们具有很高的生存能力，并以前所未有的规模组装成复杂的分支管道状结构。肝脏dECM水凝胶诱导永生化小鼠小胆管上皮细胞（胆管细胞）在体外形成复杂的胆管网络。此外，dECM水凝胶的固有生物活性和牺牲生物材料的3D打印可用于通过改变dECM结构的几何形状（宽度和角度）来创建空间定义的3D胆管树，以引导胆管树的方向。这些结果证明了dECM水凝胶对胆管网络形成的影响，并表明dECM水凝胶未来可用于肝内胆管组织工程。

3.1.3. 类器官培养

类器官是三维多细胞构建体，是组织修复的细胞来源，可用于各种疾病模型中的组织再生和治疗。通常，类器官可以在3D水凝胶系统中培养。肠ECM凝胶可以支持肠类器官和其他内胚层衍生组织（如肝脏、胃和胰腺）的细胞培养。此外，在溶解的LEM、3D胶原凝胶类器官和传统2D培养物中，无水凝胶的类器官与类器官的比较表明，自包含的3D肝脏衍生的dECM水凝胶LEM凝胶可以组织人类肝癌（Huh7）细胞、骨髓间充质干细胞和脐静脉内皮细胞（HUVEC）以创建类器官。肝细胞的上皮表型具有较高的细胞活力，肝细胞特异性基因的表达和功能显著增加。因此，dECM水凝胶可以为类器官培养提供支持。

3.1.4. 脱细胞ECM衍生生物墨水

3D生物打印是一种用于工程组织的强大技术，用于研究体外细胞行为和组织特性。3D生物打印的主要先决条件之一是找到合适的生物墨水，该墨水提供支持细胞生长和成熟的组织特异性微环境。支持细胞粘附、分化和增殖的生物基材料，包括明胶、透明质酸、胶原蛋白和藻酸盐，已成功用作生物墨水。特别是，脱细胞细胞外基质（dECM）已成为一种有前途的材料，具有维持天然组织的生化和地形微环境的独特能力。研究表明，可光交联的肾脏ECM衍生生物墨水（KdECMMA）可以为肾脏组织生物打印提供肾脏特异性微环境。猪全肾通过灌注法脱细胞，溶解在酸溶液中，并通过甲基丙烯酸进行化学修饰。基于KdECMMA的生物墨水被配制并评估了印刷过程的流变特性和印刷性能。结果表明，KdECMMA生物墨水中的生物打印人肾细胞是高度存活的，并且随着时间的推移而成熟。此外，生物打印的肾结构表现出天然肾组织的结构和功能特征。组织特异性ECM衍生生物墨水的潜力被证明可用于基于细胞的生物打印，这可增强细胞成熟并最终形成组织。上述研究表明，使用dECM水凝胶作为生物墨水的3D生物打印策略在未来再生医学应用的生物工程功能组织构建中具有巨大潜力。

从健康或恶性组织中提取和纯化脱细胞细胞外基质（dECM）的最新进展为工程生理学模拟3D体外肿瘤模型开辟了一条新途径。研究表明，来自大鼠和人类来源的3D生物打印自凝胶化乳腺脂肪组织衍生的基于dECM的水凝胶能够产生与不同乳腺癌细胞结合的器官型构建体，证明了使用组织特异性ECM作为TME-ECM癌细胞相互作用分析的基础的重要性，以及需要仔细建立与其他非组织特异性源自ECM的生物材料的观察结果的比较。这对于理解ECM在发育生物学、组织工程和癌症治疗中控制细胞命运的作用具有重要意义。

3.2. dECM水凝胶的体内应用

ECM水凝胶已广泛用于许多临床前研究，以促进损伤后的组织修复，包括心脏、肺、脑、神经和结肠。

3.2.1. 心脏病心血管疾病是对人类健康的常见严重威胁。一半以上死于心血管疾病的患者患有心肌梗死。心肌梗死的病理变化是动态的。这些变化始于炎症阶段；然后，坏死的心肌纤维溶解吸收，肉芽组织逐渐形成，最后形成致密的胶原瘢痕。心肌梗死（MI）后发生左心室重构，可导致心力衰竭。在晚期心力衰竭中，只有心脏移植或植入左心室辅助装置才能有效治疗。在大鼠MI模型中注射源自心室细胞外基质（ECM）的可注射水凝胶可增加梗死区域内内源性心肌细胞的数量，并维持心脏功能，而不会导致心律失常。Seif Naraghi及其同事开发了一种源自猪心肌细胞外基质的可注射水凝胶。MI后两周，经皮心内注射心肌基质水凝胶用于治疗患有MI的猪。MI后注射的心肌基质水凝胶可以改善心脏功能，防止左心室负重塑，并增加心肌活性。通过在全MI大鼠模型中使用全转录组分析，研究了心肌ECM注射治疗效果的组织水平机制。转录组的主成分分析显示，注射基质的梗死心肌表现出炎症反应的变化、心肌细胞凋亡的减少、梗死区域新血管形成的增加、心肌肥厚和纤维化的减少、代谢酶表达的变化、，与注射生理盐水的对照组相比，心脏转录因子表达增加，祖细胞募集，心脏功能和血流动力学总体改善。这些结果表明，dECM水凝胶可以促进血管生成并维持心脏功能。

3.2.2. 肺胸部肿瘤（如肺癌、乳腺癌和食管癌）的发病率增加，使放射治疗成为治疗胸部肿瘤的重要方法；放疗的疗效与放疗剂量呈正相关。然而，胸部肿瘤的放射治疗会导致放射性肺损伤，因为周围的正常肺组织容易受到辐射。放射性肺损伤在后期会导致纤维化，无法逆转，并导致肺功能严重受损，甚至死亡。上皮间充质转化（EMT）在辐射诱导的肺纤维化中起着重要作用。因此，在辐照后将源自肺组织的ECM水凝胶注射到大鼠气管中，以研究对辐射诱导的肺损伤的保护作用。将大鼠以仰卧姿势固定在木板上，以充分暴露胸部。照射场的上边界对应于连接两个腋窝中点的线，照射场的下边界对应于剑突下边缘的下边缘平面；身体的其余部分由一个12mm的引线块屏蔽。IR+NS和IR+ECM组的大鼠用6MV X射线直线加速器在100cm的源面距离照射，剂量为20Gy，剂量率为3.5Gy/min。两个治疗组在放疗后半小时内向气管内注射500μl肺ECM水凝胶或等量生理盐水。随后的实验在照射后4、8和16周进行。干/湿重量比用于评估肺充血和水肿。苏木精和伊红染色以及Masson三色染色用于肺组织的组织病理学分析。进行免疫组织化学染色和Western blot分析，以确定肺组织中上皮-间质转化（EMT）相关蛋白（E-钙粘蛋白、α-平滑肌肌动蛋白[α-SMA]和波形蛋白）的表达。此外，还检测了肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、转化生长因子-β1（TGF-β1）、白介素-6（IL-6）、羟脯氨酸、丙二醛（MDA）和超氧化物。还评估了超氧化物歧化酶（SOD）的水平。结果表明，ECM衍生水凝胶具有良好的细胞相容性和组织相容性，ECM衍生的水凝胶处理对肺组织病理学损伤和肺水肿具有有益的影响。IR+ECM组E-cadherin表达明显高于IR+NS组，波形蛋白和α-SMA表达水平明显低于IR+NS；此外，dECM水凝胶处理降低了羟脯氨酸水平。照射后TNF-α、IL-6和TGF-β1水平显著升高。用ECM衍生的水凝胶处理辐照大鼠后，MDA含量显著降低，SOD水平升高。dECM水凝胶治疗减少了辐射诱导的肺纤维化，减少了EMT和辐射诱导的肺部损伤，并提高了大鼠在辐射后的存活率。结果表明，dECM水凝胶作为一种可注射的生物支架，对受损组织的修复具有一定的作用。

3.2.3.  脑ECM水凝胶已广泛用于修复脑损伤和治疗中风。为了评估脑组织对膀胱细胞外基质水凝胶（UBM）注射的反应，将凝胶形式的UBM注射到健康大鼠的大脑中，并在第1、3和21天检查脑组织对UBM的反应。UBM的应用不会激活小胶质细胞，不会增加星形胶质细胞的数量，也不会在神经变性过程中引起炎症，这表明UBM对正常大脑没有毒性作用。将UBM注入脑损伤（TBI）大鼠同侧海马CA3区；数据表明，UBM的应用减少了损伤体积和白质损伤，UBM治疗可导致通过前庭功能评估的TBI后神经行为的显著恢复和运动功能的改善。然而，UBM治疗对认知恢复没有显著影响。该研究表明，UBM与脑组织具有生物相容性，并对受伤的大脑具有一定的保护作用。

在慢性中风动物模型中，UBM的浓度决定了其在腔或组织中的渗透；因此，UBM浓度影响水凝胶与宿主大脑的相互作用。其中，浓度为4 mg/mL的A达到92%的覆盖率（范围为88–97%），浓度为8 mg/mL的覆盖率为89%。过高或过低的浓度都不合适浓度为8 mg/mL时，约60%的浸润细胞具有脑源性表型，30%的浸润细胞是向M2抗炎表型极化的外周巨噬细胞。因此，浓度为8 mg/mL的ECM可以促进急性内源性修复反应，并可能用于治疗中风。中风后第14天植入中风腔中的浓度为0、3、4和8 mg/mL的猪源性膀胱基质（UBM）-ECM水凝胶的组织学评估表明，植入后14天内，浓度为3和4 mg/mL的水凝胶可有效生物降解，以促进病变腔中的组织恢复。相比之下，更高浓度（8 mg/mL）的ECM水凝胶仅表现出轻微的生物降解，不会导致组织恢复。感觉水凝胶比脑组织弱，它提供了促进内源性再生反应的合适条件，这可以恢复空腔中的组织。该方法为未来治疗中风和其他急性脑损伤引起的慢性组织损伤提供了新的手段。因此，注射dECM水凝胶可以促进免疫细胞浸润并减少脑损伤。

3.2.4.  脊髓中枢神经系统（CNS）受损后，胶质瘢痕的形成抑制了新轴突的生长，导致中枢神经系统缺乏再生，临床治疗效果不佳。从小鼠胚胎干细胞（mESC）衍生的星形胶质细胞中收获细胞外基质（ECM），以制备透明质酸（HA）水凝胶。将从原生质（灰质）星形胶质细胞收获的ECM并入水凝胶中，并植入脊髓损伤（SCI）大鼠；这一过程减少了胶质瘢痕的大小，增加了轴突对损伤的穿透，并减少了小胶质细胞中巨噬细胞的数量。HA水凝胶支持V2a中间神经元的移植，并增加SCI损伤中和周围的神经元突起面积[124]。在脊髓损伤大鼠中注射神经dECM水凝胶一周后显著降低了M1:M2巨噬细胞的比例，这有利于再生表型（p

3.2.5. 在溃疡性结肠炎（UC）啮齿动物模型中局部递送结肠脱细胞猪小肠粘膜下层ECM水凝胶（ECMH），以确定ECM诱导的生物效应是否影响UC啮齿动物模型。在这种啮齿类动物模型中，ECMH可以粘附在结肠组织上，ECMH治疗可以减少UC的临床症状。用ECMH治疗的动物体重减轻，便血减少。组织形态学分析表明，ECMH在该模型中具有治疗作用，使用ECMH可减少第7天和第14天结肠远端和近端部分的炎症和溃疡症状。与阴性对照组相比，ECMH治疗可使E-钙粘蛋白阳性细胞的数量增加约50%。ECMH治疗导致colabeled CD68+/TNFα+细胞数量减少，表明ECMH通过减少结肠中存在的炎性巨噬细胞数量直接调节巨噬细胞反应。结果表明，dECM水凝胶具有良好的生物特性和低免疫原性，可为后续临床试验提供基础。

4. dECM材料的商业应用

来自动物源的ECM衍生产品已上市20多年，并已在多种应用中商业化使用。ECM材料和支架由脱细胞组织和源自许多动物和人类组织的器官制成，在伤口愈合、外科闭合和加固以及跨越大缺陷的组织重建中具有许多临床应用。目前可用的临床产品包括：Oasis®（猪小粘膜下层，Cook Biotech）、GraftJacket®（人类真皮，Acelity L.P.Inc.）、DermACELL®（人真皮，Novadaq Technologies）、Alloderm®（人类皮肤，Allergan plc）、，CuffPatch®（猪小肠粘膜下层,  Arthrotek）、TissueMend®（胎牛皮肤, TEI Biosciences）、Permacol®（猪真皮, Tissue Science Laboratories）、MatriStem®（伤口护理基质,  ACell, Inc.)、MatriStem®粉末（ACell, Inc）、DuoDerm®（ConvaTec）、NeoForm™ （人类真皮，美国加利福尼亚州），Strattice™ （猪真皮，Allergan plc），GraftJacket™ （人类皮肤, Wright Medical Technology）Restore™（猪小肠, DePuy Orthopedics），Prima™ Plus（猪心脏瓣膜，Edwards Life Sciences LLC），AlloSkin™ AC（人类真皮，AlloSource），MatriStem®（膀胱粘膜， ACell），Biodesign®（小肠，COOK MEDICAL INC.），Lyoplant®（心包，Aesculap, Inc.）。

5. dECM水凝胶的前景

dECM水凝胶已被广泛用作传统的组织工程方法；此外，dECM水凝胶可以显著促进各种损伤组织的修复和体外细胞培养。然而，组织dECM的来源、凝胶化条件和水凝胶的各种蛋白质浓度可能会影响dECM水凝胶的结构。例如，最近形成的来源的重组可能高于前段时间形成的来源。dECM预凝胶的粘度和凝胶动力学在其可注射性和在特定部位的保留中起着重要作用，以评估其在微创手术中的成功应用。dECM水凝胶在体内的治疗效果主要取决于dECM水凝胶的生物学和力学性质。dECM的生物学特性可由生物材料和动物组织来源决定。然而，通过调节dECM溶液的pH、盐或离子浓度和温度来制备dECM水凝胶只能在一定程度上促进凝胶化，并且不能显著改善dECM水凝胶的机械性能。因此，新的官能团通过物理和化学方法交联，以改善dECM水凝胶的机械性能并促进受损组织的修复。新交联方法的应用促进了合成水凝胶的发展。具有更好机械和生物性能的dECM水凝胶产品将继续出现，为临床组织修复提供更多选择。未来的尝试应集中于将dECM水凝胶用作药物递送载体，以促进受损组织的原位修复。天然ECM的复杂性表明，一种或多种生物成分的应用不足以实现天然ECM的特性；因此，来自各种组织来源的dECM水凝胶可以用作3D生物打印中的生物墨水，以在新的方向上推进组织工程。

参考文献来源：

Zhang W, Du A, Liu S, et al. Research progress in decellularized extracellular matrix-derived hydrogels[J]. Regenerative Therapy, 2021, 18: 88-96.

文章来源：生物材料与医学应用