使用说明： 1.准备工作： a.裂解液溶解后混匀并置于冰浴上备用。 b.检测缓冲液溶解后混匀并置于冰浴上备用。 2.测定pNA标准曲线： a.标准品稀释液的配制：按照每0.9ml检测缓冲液加入0.1ml裂解液的比例配制适量的标准品稀释液。 b.把试剂盒提供的pNA (10mM)用标准品稀释液稀释为0、10、20、50、100和200μM，作为标准品。 c.每个浓度取100μl用酶标仪进行检测，或取适当量用容量不超过100μl的分光光度检测杯进行检测，测定A405。 d.每一个标准品的A405减去不含pNA的空白对照的A405计算出实际的因pNA而导致的吸光度，并制作出pNA浓度相对于A405的标准曲线。pNA标准曲线可以参考图1，在0-200μM范围内存在良好的线性关系。

图1.pNA标准曲线。实测数据可能因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

3.样品的收集： a.对于悬浮细胞：把没有诱导凋亡的对照样品和诱导凋亡的样品，600g 4℃离心5分钟收集细胞，小心吸除上清，同时确保尽量没有细胞被吸除，PBS洗涤一次。同前吸尽上清后，按照每200万细胞加入100微升裂解液的比例加入裂解液（如果裂解不充分，可以把裂解液的用量提高至150或200微升），重悬沉淀，冰浴裂解15分钟。下转步骤3d。 b.对于贴壁细胞：吸取细胞培养液，备用。用胰酶消化贴壁细胞，并收集至备用的细胞培养液中。600g 4℃离心5分钟收集细胞，小心吸除上清，同时确保尽量没有细胞被吸除，PBS洗涤一次。同前吸尽上清后，按照每200万细胞加入100微升裂解液的比例加入裂解液（如果裂解不充分，可以把裂解液的用量提高至150或200微升），重悬沉淀，冰浴裂解15分钟。下转步骤3d。 c.对于组织样品：按照每3-10mg组织加入100微升裂解液的比例加入裂解液，在冰浴上用玻璃匀浆器匀浆。然后把匀浆液转移到1.5ml离心管中，冰浴再裂解5分钟。 d.4℃ 16,000-20,000g离心10-15分钟。 e.把上清转移到冰浴预冷的离心管中。 f.立即测定caspase 3的酶活性或-70℃保存样品。同时可以取少量样品用Bradford法测定蛋白浓度，尽量使蛋白浓度达到1-3mg/ml，相当于每10微升待测样品中至少含有10-30μg蛋白。如果细胞较小，可以适当增加细胞的用量。 4.Caspase 3酶活性的检测： a.取出适量的Ac-DEVD-pNA(2mM)，置于冰浴上备用。 b.如下设置反应体系：

注意：在设置反应体系时先加检测缓冲液，再加待测样品，适当混匀，注意避免在混匀时产生气泡。随后再加入10μl Ac-DEVD-pNA(2mM)。 c.加入Ac-DEVD-pNA(2mM)后混匀，注意避免在混匀时产生气泡。37℃孵育60-120分钟。发现颜色变化比较明显时即可测定A405。如果颜色变化不明显，可以适当延长孵育时间，甚至可以孵育过夜。 d.样品的A405扣除空白对照的A405，即为样品中caspase 3催化产生的pNA产生的吸光度。通过同步骤1中获得的标准曲线的对比就可以计算出样品中催化产生了多少量的pNA。 e.参考Chemicon公司的caspase 3酶活力单位的定义：One unit is the amount of enzyme that will cleave 1.0nmol of the colorimetric substrate Ac-DEVD-pNA per hour at 37℃ under saturated substrate concentrations。即一个酶活力单位定义为当底物饱和时，在37℃一个小时内可以剪切1nmol Ac-DEVD-pNA产生1nmol pNA的caspase 3的酶量。这样就可以计算出样品中含有多少个酶活力单位的caspase 3。说明：在本试剂盒的检测体系中，底物的起始浓度为 0.2mM，此时底物是饱和的，对于许多样品而言在37℃孵育2个小时以内底物都是饱和的；对于样品中caspase 3酶活力特别高的情况，须用裂解液适当稀释样品后再进行测定。 f.用Bradford法检测待测样品中的蛋白浓度(由于裂解液中含有较高浓度的DTT，不适合采用BCA法进行蛋白浓度测定)。这样就可以计算出一个样品单位重量蛋白中所含的caspase 3的酶活力单位。 常见问题： 1.测定出的A405过低： A.样品中蛋白含量太低，裂解样品时需设法使样品中的蛋白浓度至少达到1-3mg/ml。 B.样品中激活的caspase水平很低。首先确认凋亡现象是否明显，如果凋亡比较明显并且确认该caspase是可以被激活的，可以适当调节诱导细胞凋亡的时间，希望能找到一个caspase激活比较强的时间点，这样就可以检测出该caspase的激活。可以作一时间曲线，例如诱导凋亡0、2、4、8、16和24小时，或0、1、2、4、8和16小时，或0、1、2、4、6和8小时等。具体的诱导凋亡时间需根据具体情况而定。 2.测定出的A405过高或者样品量不足： 测定出来的A405读数过高时，可以参考下表的反应体系适当减少样品的用量；样品量不足时也可以参考下表减少样品的用量。

说明：其中x不超过50，其余检测方法同上面的使用说明所述。 相关产品：