陈晓殷 李文静 朱卓丽 李雄娟 黄焕森

摘要：萄糖调节蛋白78（GRP78）是首个被发现的内质网分子伴侣，同时被视为内质网应激反应的经典标志性蛋白分子，在细胞内发挥多重功能。目前已在肿瘤、大脑缺血再灌注损伤等病理组织器官中发现GRP78异常上调表达，GRP78作为肿瘤与脑血管缺血性疾病的治疗靶点的应用前景不可忽视。本文主要从GRP78的分子结构、正常生理功能、涉及的内质网应激反应相关机制、GRP78与肿瘤、缺血再灌注损伤的预后等方面进行综述，旨在揭示GRP78的功能作用，明确其在肿瘤、缺血再灌注损伤发生发展过程中的作用。

关键词：GRP78;内质网应激;肿瘤;缺血再灌注损伤

中图分类号：R34                                   文献标识码：A                                   DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.20.008

文章编号：1006-1959（2020）20-0026-04

Study on the Role of Glucose Regulatory Protein 78

CHEN Xiao-yin1，LI Wen-jing1，ZHU Zhuo-li2，LI Xiong-juan2，HUANG Huan-sen2

（1.Department of Anesthesiology，the Second Clinical College of Guangzhou Medical University，Guangzhou 511436，Guangdong，China;

2.Department of Anesthesiology，the Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510260，Guangdong，China）

Abstract：Glucose regulatory protein 78 （GRP78） is the first endoplasmic reticulum molecular chaperone to be discovered， and it is also regarded as a classic protein molecule of endoplasmic reticulum stress response， which performs multiple functions in cells. At present， abnormally up-regulated expression of GRP78 has been found in tumors， cerebral ischemia-reperfusion injury and other pathological tissues and organs. The application prospect of GRP78 as a therapeutic target for tumors and cerebral ischemic diseases cannot be ignored. This article mainly reviews the molecular structure of GRP78，the normal physiological functions， the related mechanisms of endoplasmic reticulum stress response， GRP78 and tumors， and the prognosis of ischemia-reperfusion injury are reviewed in order to reveal the functional role of GRP78 and clarify its occurrence in tumors and ischemia-reperfusion injury role in the development process.

Key words：GRP78;Endoplasmic reticulum stress;Tumor;Ischemia-reperfusion injury

葡萄糖调节蛋白78（glucose regulated protein 78，GRP78）是热休克蛋白70（heat shock protein 70，Hsp70）家族成员之一，也被称为免疫球蛋白重链结合蛋白（immunoglobulin heavy chain binding protein， Bip）。近期大量研究表明GRP78参与内质网应激、肿瘤、脑缺血再灌注损伤的调节。本文主要就GRP78的分子结构和生理功能及其在内质网应激、肿瘤生长和治疗、脑缺血再灌注损伤中的调节作用及机制的研究进行综述。

1 GRP78的分子结构和正常生理功能

GRP78主要定位于内质网上，是细胞内质网腔蛋白质合成质控的重要分子伴侣，参与各种细胞的生理过程。GRP78有三个结构域，包括C端多肽的结合部位（peptide-binding结构域）、C末端活性调节区域和N端结合ATP的结构域（ATPase功能域）。Peptide-binding结构域结合未折叠或错误折叠的蛋白多肽，在蛋白质二硫键异构酶作用下可促进蛋白质形成正確的二硫键，保持正确的天然构象。N端ATPase功能域结合ATP/ADP，当其与ADP结合，C末端活性调节区域使多肽氨基酸残基与peptide-binding结构域结合更紧密;而与ATP结合时，多肽链则从peptide-binding结构域上释放出来[1]。有研究表明，peptide-binding结构域与ATPase功能域调控细胞增殖的作用具有差异性，独立的APTase功能域可能抑制细胞增殖，而独立的peptide-binding功能域可能促进细胞的增殖，这两个结构的存在共同调节着细胞的增殖[2]。

在正常生理情况下，GRP78通过GRP78-ERdj3循环以协助细胞正确加工处理新合成的未折叠多肽链。起初，DnaJ蛋白与未折叠多肽链结合在一起，形成ERdj3-多肽链复合物，这有利于阻止未折叠多肽链的聚集。紧接着N端结合有ATP的Hsp70与DnaJ蛋白相互作用，从而保证Hsp70能被招募靠近未折叠多肽链，形成ATP-GRP78-ERdj3-多肽链复合物。ATP的存在对GRP78介导的多肽链从ERdj3中释放至关重要。一方面，当ATP缺失时，GRP78无法与ERdj3相互作用;另一方面，如果多肽链尚未从ERdj3上释放出来，而ATP已被水解成ADP，这也将导致DnaJ区域与Hsp70结合不牢固，甚至出现解离现象。此外，DnaJ蛋白可以感知识别GRP78的ATP酶活性被激活或者GRP78具有依赖ATP把多肽链扭曲变构的能力，如果DnaJ蛋白突变，这将会延长BiP与ERdj3的结合时间。由此可见，GRP78对于细胞合成及运输正常生理功能的蛋白质起着重要作用[3]。

2 GRP78与内质网应激

GRP78在内质网应激中起着重要的调节作用。在细胞内钙离子浓度的改变、氧化还原环境紊乱、蛋白质变异、二硫键减少、缺乏分子伴侣或细胞能量等情况下，内质网结构与功能失衡，细胞启动自我保护机制，即内质网应激反应（ERS）以对抗应激源。当组织细胞受到缺氧、低钙、感染等刺激时，内质网大量合成GRP78，以维持细胞正常的生理功能，GRP78表达量在内质网应激时可升高至正常的数倍，过度表达的GRP78可视为未折叠蛋白反应（UPR）发生的标志。

内质网应激持续发生时，过度表达的GRP78可导致钙稳态紊乱从而引起细胞凋亡，其机制主要是因为内质网内钙耗竭与胞质内钙超载。内质网内钙离子的减少会改变ER内腔蛋白质组和分泌组的组成从而影响细胞功能和细胞活力[4]。有研究发现[5]，在常染色体显性遗传性视网膜色素变性大鼠中，持续激活内质网应激反应时，会发生感光细胞中内质网钙外流，引起胞质钙超载和钙蛋白酶的激活，导致细胞凋亡与视网膜变形。在内质网应激反应期间，GRP78可通过调节内质网钙离子渗漏从而影响细胞凋亡。最新研究发现，GRP78过表达可保护心肌细胞免受阿霉素毒性的损害[6]。强烈的热应激可能通过介导细胞质钙超载、激活线粒体凋亡途径继而调节促凋亡蛋白（如caspase9、caspase3、Apaf-1）的释放[7]。

在发生 UPR时，GRP78从内质网膜上的跨膜蛋白N端上解离出来，转而与内质网内蓄积过多的未折叠蛋白或错误折叠的蛋白质结合，以防止未折叠蛋白之间聚集。与此同时，与GRP78的解离导致细胞膜上三种内质网跨膜蛋白的激活，分别是双链RNA依赖的蛋白激酶ER激酶（PERK）、激活转录因子6（ATF6）、肌醇酶1（IRE-1），从而启动UPR，调节内质网应激反应。当ERS过强或反应时间过长时，内质网功能不可逆地严重受损，细胞会启动凋亡信号通路，可通过激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12（caspase-12）途径引发凋亡相关信号传递、c-Jun氨基末端激酶（JNK）信号转导通路和CHOP促凋亡途径来诱导细胞凋亡[8-11]。

3 GRP78与肿瘤的关系

GRP78的表达与肿瘤的侵袭深度、TNM分期及分化程度呈正相关。胃癌患者GRP78表达强度与肿瘤患者的生存期和复发率相关，GRP78高表达患者的生存期较低，而复发率则显著增高[12]。因此，研究GRP78与肿瘤生长转移的关系有利于我们在临床中正确地对肿瘤进行诊断分期、治疗与判断预后。有研究发现[13]，人类非小细胞型肺癌中肿瘤细胞倾向于侵袭较高基础量的GRP78蛋白及其mRNA表达的细胞。由于肿瘤细胞具有代谢旺盛、生长迅速、线粒体功能障碍、蛋白质合成大于分解等代谢特点，肿瘤细胞内容易出现营养物质缺乏、缺氧、代谢物质堆积、酸中毒等问题，从而引起内质网应激反应及GRP78表达量增多。GRP78可通过调节Wnt信号通路从而诱导转录因子HOXB9过度表达，以促进肝癌细胞的侵袭和迁移[14]。在缺氧状态下，Wnt信号通路的异常活化可导致正常细胞向肿瘤细胞转变，诱导组织细胞过度增生。

GRP78具有抗凋亡、促进肿瘤细胞生长的作用。有研究表明[15]，GRP78基因沉默时可通过诱导内质网应激依赖性细胞显著抑制结肠癌细胞的生存能力并增加肿瘤细胞凋亡。一方面，熒光显微镜下证实GRP78的一个亚群作为内质网跨膜蛋白，与caspase-7共定位，且免疫共沉淀研究进一步揭示了GRP78可与caspase-7前体结合形成复合物并抑制caspase-7的活化，进而抑制细胞凋亡[16]。近期研究表明[17]，肿瘤抑制因子KIAA1324可能在内质网中释放与GRP78结合的caspase-7，抑制GRP78与caspase-7的相互作用进而诱导胃癌细胞凋亡。有研究发现，GRP78可抑制BIK的凋亡活性，通过竞争结合BIK并且改变其构象从而减少BIK与Bcl-2结合，减少内质网Ca2+的释放，抑制细胞凋亡[16]。抑癌基因p53可通过诱导BIK的表达、同时抑制GRP78的表达使GRP78/BIK复合物解离，从而促进BIK与Bcl-2的结合，促使细胞凋亡[18]。当GRP78表达被抑制时，可明显上调caspase-12的表达和促进内质网应激诱导的caspase-4激活，并伴有细胞凋亡增快的现象[19，20]。另一方面，当肿瘤细胞发生内质网应激时，GRP78与促凋亡蛋白CHOP的含量与活性差值大小将决定细胞是存活亦或是凋亡。当CHOP高表达时，可诱导细胞周期停滞和细胞凋亡[21]。另有研究发现，高水平表达的GRP78可结合CHOP的N端结构域以调节CHOP的蛋白酶体转换，以p300依赖的方式加速CHOP泛素化，从而抑制内质网应激诱导的细胞凋亡[22]。因此，肿瘤细胞中高表达的GRP78可抑制凋亡从而促进肿瘤细胞存活。

当GRP78基因沉默时，不仅能增加细胞脂质含量、促进脂质过氧化和增加活性氧簇的生成，而且可以增加循环趋化因子MCP-1聚集并将巨噬细胞募集到肿瘤微环境中[23]。临床数据显示CD47在多种人类实体瘤中表达上调，并与较差的生存率相关[24]。当沉默GRP78基因时可显著降低LCC9乳腺癌细胞中CD47的表达，这种作用有利于增强肿瘤细胞的免疫识别能力及对T细胞与巨噬细胞介导的细胞毒性的敏感性[23]。因此GRP78在肿瘤细胞中通过调节细胞代谢水平而调节细胞的存亡。

GRP78对肿瘤侵袭转移也發挥着调控作用。采用免疫组化检测前列腺癌患者的肿瘤组织时发现，高等级前列腺癌细胞比低等级肿瘤细胞免疫染色更强[25]。另外，在食管鳞状细胞癌（ESCC）患者中，高转移细胞中的GRP78表达明显高于ESCC非转移细胞。体内外研究中都可发现GRP78的下调能显著抑制ESCC细胞的转移潜力[26]。当使用GRP78 siRNA或敲除GRP78基因干扰或阻断GRP78在细胞表面的表达时，可使肿瘤细胞的侵袭浸润能力相应降低[27]。上述研究说明GRP78在肿瘤的侵袭转移中起着重要作用。

近年来大部分转移癌患者治疗失败的原因归结于肿瘤细胞对抗癌药物产生了耐药性。GRP78的过度表达是癌细胞对标准抗癌治疗药物产生耐药性的其中一种机制。研究表明，抗雌激素乳腺癌细胞系表达高水平的GRP78[27]，因此肿瘤细胞中GRP78表达上调是内分泌治疗耐药性的一个驱动因素。与单独使用他莫昔芬（TAM）相比，联合使用GRP78抑制剂及他莫昔芬疗法可使小鼠乳腺肿瘤的重量与面积明显缩小。因此，抑制GRP78可恢复或增强乳腺癌细胞的内分泌治疗敏感性[23]。鼻咽癌细胞亦可通过激活GRP78从而对放疗化疗产生的耐药作用[28]。小分子治疗药物CXL146可降低多重耐药癌细胞株中GRP78的表达，继而恢复癌细胞对标准疗法的敏感性[29]。肿瘤细胞可能通过上调GRP78的表达继而降低对抗癌药物的敏感性，因此，癌症标准疗法结合GRP78抑制剂可作为癌症治疗的一种新方法。由于GRP78存在于癌细胞的细胞表面，因此GRP78已成为抗癌小分子药物的靶标。最新的研究发现，能靶向结合细胞表面GRP78抗体的纳米颗粒mAb GRP78-NPs可将药物有效地转运至肿瘤细胞中，通过有效抑制癌细胞的侵袭能力从而发挥抗肿瘤作用，这给开发具有特定靶向治疗作用的纳米载体提供了可能性，能够提高抗肿瘤药物的靶向性，减少其对正常细胞的毒性作用，为癌症患者的治疗方法提供新的研究方向[30]。

4 GRP78与大脑缺血再灌注损伤

脑缺血再灌注损伤后，由于脑细胞缺血、缺氧导致自由基增多、钙超载、炎症级联反应、内质网应激反应，使得GRP78表达水平显著升高[31]，并且可观察到缺血半暗区神经细胞凋亡的增加，提示大脑缺血再灌注损伤与内质网应激及细胞凋亡相关。正常神经细胞内的GRP78仅微弱表达，但是在缺血缺氧等应激反应中，GRP78与PERK，ATF6，IRE1三种蛋白质解离，暴露各自的结构域。其中的ATF6作用于启动子，激活核酸内切酶IRE-1α，上调GRP78相关基因的转录与翻译。GRP78能与错误折叠蛋白和未折叠蛋白相结合，从而促进蛋白质的正确折叠，维持细胞的正常生理功能。有研究显示，轻度的内质网应激反应即可引起GRP78的表达上调，使内质网自身保护作用达到最佳水平，并抑制促凋亡蛋白CHOP的表达[32]，使神经细胞得以存活。但GRP78的保护作用有限，当脑组织缺血缺氧时间延长，再灌注后其损伤程度加剧，长时间或过强的内质网应激不仅无法继续维持神经细胞的功能，甚至可以诱导CHOP[8]、caspase-12[9]、JNK[10]等表达，此时GRP78可激活凋亡信号转导通路，使GRP78从抗凋亡作用向促凋亡转变。另外，大脑缺血再灌注后，大量炎症细胞因子（如TNF-α、IL-6等）参与脑细胞凋亡[33]，这意味着减少炎症因素可减轻大脑缺血再灌注损伤。近期有研究发现，右美托咪定对脑缺血再灌注损伤具有神经保护作用，可以显著降低脑缺血再灌注引起的神经功能缺损评分和脑水肿脑梗死面积，同时神经细胞凋亡也显著降低。其保护机制可能与显著降低GRP78后下游PERK-CHOP-Caspase-11依赖性信号通路有关[34]。

5总结

随着社会的进展，人类生活方式与生存环境的改变，肿瘤、急性缺血性中风等疾病已越来越影响人类健康，甚至危及生命。GRP78作为首个被发现的内质网分子伴侣，在细胞内发挥着多种功能，通过研究认识其在疾病的发生与进展中的作用，我们可以寻找疾病治疗的潜在靶点，为患者的治疗方法提供新的方向。在肿瘤细胞表面高表达的GRP78是一个功能分子靶点，GRP78可促进癌细胞生长浸润转移、抑制凋亡，并且影响癌细胞对抗癌药物的敏感性。针对GRP78的治疗方法可提高抗癌药物的疗效，减轻毒副作用，有利于肿瘤患者的治疗和康复。大脑缺血再灌注后细胞发生内质网应激反应时，导致GRP78表达量升高，同时伴有大量炎症因子及细胞凋亡增加的现象，这意味着在脑缺血再灌注疾病中，降低GRP78的表达可抑制炎症反应及细胞凋亡，从而发挥细胞保护的作用。

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收稿日期：2020-06-04;修回日期：2020-07-14

編辑/成森

医学信息2020年20期