抗体偶联药物( antibody-drug conjugate，ADC)是一种将单克隆抗体药物的高特异性和小分子细胞毒药物的高活性相结合，用以提高肿瘤药物的靶向性、减少毒副作用的药物。和传统的抗体或抗体片段相比，ADC因为能在肿瘤组织内释放高活性的细胞毒素，因此理论上其疗效更高。ADC从发展到现在已经经历了三个阶段的发展：

第一代ADC：初代ADC所用的抗体为鼠源抗体或者嵌合抗体，连接子不够稳定；因为采用非定点偶联，因此DAR值不可控制。以上特点导致其药效较差，毒性/副作用较强，免疫原性强，半衰期较短。

第二代ADC：第二代ADC药物在第一代的基础上进行改进，在抗体方面选择与抗原亲和力较好的抗体，减少与正常组织的交叉反应，并且进行人源化减少免疫原性。在小分子毒物方面选择效果更好的MMAE，MMAF等小分子毒物。Linker为可降解和不可降解两种linker。与上一代ADC药物相比，具有更高的靶向性，较高的药效，较低的免疫原性。但是还存在毒副作用较强，会出现耐药性，高DAR值导致药物被快速清除等问题。

第三代ADC：第三代ADC在第二代的基础上继续改进，利用小分子毒物与人源单克隆抗体进行定点偶联，DAR值更均一，并且有多种差异化的小分子毒物可以选择。与前两代ADC相比。稳定性和药代动力学大大提高，药物活性更高，毒性更低。

伴随着三代ADC药物发展，抗体偶联技术也经历的三代的发展，从第一代的非定点偶联，到第二代基因工程改造的定点偶联，再到第三代不依赖基因工程改造的定点偶联。本篇文章我们将要对三代偶联技术进行全面分析，并重点介绍不依赖基因工程改造的定点偶联技术。

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第一代抗体偶联技术

将抗体的特异性与药物的毒性结合并创造出一种具有更高层次的靶向药物的概念可以追溯到1913年，当时Paul Ehrlich提议开发一种 "神奇的子弹"，用于选择性地靶向治疗肿瘤。尽管这一概念简单而新颖，但是第一个ADC直到2000年才被用于临床，FDA批准了Gemtuzumab ozogamicin (Mylotarg, Pfizer/Wyeth）用于治疗急性骨髓性白血病。2011年，Brentuximab vedotin (Adcetris, Seattle Genetics)被批准用于治疗无细胞白血病。两年后，Trastuzumabemtansine (Kadcyla, Genentech/Roche) 被批准用于治疗晚期人类表皮生长因子2（HER2）阳性乳腺癌。

到目前为止，已经有14种ADC被批，包括Inotuzumab ozogamicin; Polatuzumabvedotin; Enfortumab vedotin; Trastuzumab deruxtecan;Sacituzumab govitecan; Belantamab mafodotin; Moxetumomabpasudotox；以及Loncastuximab tesirine等

在这些案例中，多数ADC药物都是通过使用第一代偶联技术抗体完成的。这些技术利用了还原的半胱氨酸残基（IgG1的4对链间二硫化物）或抗体表面暴露的赖氨酸残基（大约80个潜在的耦合点）。第一代抗体偶联方法利用N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）或马来酰亚胺介导的交联，将一个功能分子稳定地连接到赖氨酸的伯胺或半胱氨酸的硫醇基团。由于有大量的潜在反应位点，这些偶联方法必然导致ADC药物具有不同的药物-抗体比值(DAR)，因此产品的异质性较强。现在的研究证明，与均一性较强的定点偶联药物相比，这些异质性药物具有次优的治疗效果。  

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第二代抗体偶联技术

2.1 额外引入半胱氨酸

第一个系统性的证明定点偶联药物具有较好的疗效是来自于Genentech的Junutula及其同事，其利用了一种名为THIOMAB的定点偶联技术。该技术中主要是引入了一个额外的半光氨酸，在还原性条件下，引入的半胱氨酸及链间的二硫键被还原，在CuSO4的作用下氧化并再次形成二硫键，而药物最终通过马来酰亚胺化学反应偶联到额外引入的半胱氨酸上。与第一代偶联药物DAR值平均为３相比，THIOMAB的定点偶联技术ADC药物的DAR值为２。研究者利用该技术将MMAE和抗MUC16的抗体偶联，并在卵巢癌动物模型中取得了更好的疗效。更重要的是，该药物在提升疗效的同时具有更高的剂量耐受性并提高了药物在大鼠和猴血清中的稳定性。

THIOMAB™定点偶联平台

2.2 引入非天然氨基酸

由于ADC市场的增长及定点偶联技术的优势，越来越多的研究者致力于利用第二代抗体偶联技术开发ADC药物。一般来说，第二代抗体抗体偶联技术需要将一个含有反应性基团独特的位点特异性引入到抗体中，然后使用生物正交反应选择性地将一个功能分子与这个独特的基团进行选择性偶联。目前，遗传密码扩展、蛋白质标签和酶处理都被用于将独特的反应性基团定点引入蛋白质。在原核细胞和真核细胞中 ，将非经典氨基酸（ncAAs）引入蛋白质的策略，为定点偶联技术提供了 一个比较简便的方法。一种具有生物正交性的ncAA--对乙酰苯丙氨酸（pAcF）首先被用来探索定点偶联。研究者使用一个酰胺-tRNA合成对(aaRS)/tRNA，与宿主的内源性翻译机器正交，并将pAcF定点插入到曲妥珠单抗的琥珀密码子所代表的位置。利用该方法，研究者得到了含有双pAcF的曲妥珠单抗（每个重链上都含有一个）。然后将其与烷氧基胺衍生化的药物单甲基奥司他丁偶联并最终得到了DAR值为2的ADC药物，该药物展现了与一代ADC药物相同的疗效，而且其安全性有了一定程度的提高。

pAcF定点偶联

2.3 引入特定标签

虽然通过引入非天然氨基酸可以实现定点偶联，但是在生产中，非天然氨基酸很大程度的限制了抗体的表达。为了避免该问题，有研究者通过引入短肽，利用酶促反应进行定点偶联。基于醛标签的SMARTag短肽序列为CXPXR，该标签可以通过基因工程定点插入到抗体的特定位置。标签的中的半胱氨酸可以在甲酰甘氨酸生成酶（FGE）的作用下氧化为甲酰甘氨酸。Redwood Bioscience的科学家发现，含有甲酰甘氨酸位点的抗体可以利用生物正交反应进行定点偶联，肟连接和烷氧基胺和肼-Pictet-Spengler (HIPS) 连接为这类连接的两个例子。利用该技术，Redwood Bioscience开发的相关抗体已经进入临床。

SMARTag™平台

2.4 酶促反应

利用酶促反应共价键偶联的方式，有研究者利用谷氨酰胺转移酶和分选酶（sortase）进行抗体的定点偶联。谷氨酰胺转移酶可以催化谷氨酰胺和伯胺形成酰胺键。Schibli团队是第一个利用细菌的谷氨酰胺转移酶进行定点偶联的，但是其研究发现，尽管抗体中有大量谷氨酰胺存在，酶促反应只有在切除N297位点的糖或者进行N297S突变后，才可以在抗体的Gln295进行酶促反应。而其它一些研究者引入含有谷氨酰胺的短肽标签LLQGA，在谷氨酰胺转移酶的催化下可以形成DAR值为1.8-1.9的ADC药物。

利用相似的方式，分选酶（sortase）也可以对特定的氨基酸序列进行催化反应，其可以将聚甘氨酸和LPXTG短肽标签进行催化连接，因此抗体可以通过基因工程引入LPXTG短肽标签并进行定点偶联。

2.5 引入π-钳

除了利用酶促反应，有研究通过引入特定的氨基酸序列到抗体重链的末端如FCPF，这四个氨基酸含有“π-钳”可以提供一个特殊的环境并有利于其中半胱氨酸的定点修饰（对于含有“π-钳”序列的肽来说，当其一部分的“π-钳”产生了gly突变后再在存在竞争的条件下进行反应时，会只选择那些含有“π-钳”序列的肽进行定量的反应）。

小结：总的来说，第二代定点偶联技术是通过引入生物正交分子到抗体中，然后利用引进的特殊位点进行定点偶联，但是这些特殊位点的引进往往需要对抗体进行改造，这可能会改变抗体的部分性质，甚至会改变抗体的折叠或者稳定性，因此会给后续的生成研究带来一定的挑战。

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第三代抗体偶联技术

第二代抗体偶联技术虽然可以实现对抗体进行定点偶联，但是需要对抗体进行特殊改造，这在一定程度上可能会给ADC药物的开发带来一些新的挑战，因此有研究者开始考虑在不改变抗体完整的基础上，对天然的抗体进行位点特异性偶联。第三代偶联技术主要是聚焦于选择独特的氨基酸位点并利用独特的分子或者通过临近效应进行定点偶联，其主要分为以下4种：1）链间二硫键改造；2）糖基修饰；3）化学选择性的修饰；4）基于临近效应的修饰。

3.1 链间二硫键定点偶联

利用半胱氨酸将载荷偶联到抗体上，需要抗体中还原的巯基和载荷中硫醇特异性亲电子体之间发生反应。与其它基于赖氨酸残基偶联方法相比，该方法更具有一定的优势，因为抗体中半胱氨酸较少，可以使得偶联具有较高的特异性。链间的4对二硫键可以被还原成8个自由的硫醇，所以可以得到DAR值最高位8的均一ADC。二硫键再连接技术于1990年被Smith and Lawton研究团队开发，该方法可以在不影响抗体天然结构的前提下进行定点偶联。其主要分为以下4个步骤：（1）还原二硫键并得到两个具有活性的半胱氨酸；（2）载荷中的再连接试剂和其中一个半胱氨酸发生反应；（3）剩余的一个半胱氨酸和上一步生成的半胱氨酸-再连接试剂复合物发生反应，从而生成新的连接。

根据偶联试剂的不同，链间二硫键定点偶联可以分为4类（下图）：a: 单/双砜类试剂；b: 3,4-二取代马来酰亚胺；c: 二溴哒嗪二酮和; d: 二乙烯基嘧啶。但是无论何种试剂，都需要利用再还原剂如DTT，TCEP或者2-巯基乙醇的作用下还原链间的二硫键（IgG抗体中有16个二硫键，但是4个链间二硫键更易与溶剂接触，所以可以被还原），其中DTT和2-巯基乙醇需要中性或者碱性的环境，因此反应后需要去除，不然后续其可能与再桥接试剂发生反应，影响偶联的效率。而TCEP因其在1.5 < pH < 8.5范围内都可以有效还原，因此后续一半无需除去

3.1.1 单/双砜类试剂

对于双砜试剂，其首先需要通过去除一个亚磺酸盐再活化，活化后得到单砜并和抗体中的一个硫醇反应形成二硫键，剩下的一个亚磺酸盐被去除得到Michael受体并与抗体中剩余的一个硫醇反应，从而将抗体中的二硫键链间。2014年Badescu等人利用该方式与Trastuzumab抗体偶联，得到了含有MMAE的ADC药物，其DAR值为4，且在10 mM DTT还原环境中也有较高的稳定性（上图a1）后续，有研究者利用双砜试剂烷基化的中间体烯丙基砜进行偶联，该试剂因为具有较高的水溶性，因此具有更高的反应效率（上图a2）。

单砜偶联

双砜试剂烷基化偶联

3.1.2  3,4-二取代马来酰亚胺

3,4-二取代马来酰亚胺偶联是在第二代马来酰亚胺试剂（NGMs）如3,4-二卤代马来酰亚胺和二硫代马来酰亚胺等进行的偶联。单/双砜类试剂偶联相比，反应PH比较宽泛（6.2-8），并且其反应速度快，可以有效减少抗体在反应中聚集的问题（下图b）.另外，其DAR值可以通过控制反应试剂的剂量和反应时间，实现0-4不同的DAR值。

3.1.2 二溴哒嗪二酮

与3,4-二取代马来酰亚胺反应机制类似，有研究者利用二溴哒嗪二酮进行偶联。二溴哒嗪二酮型杂环中的两个N原子给偶联反应提供了可能，在该反应中，研究者实现了一步偶联，从而减少了偶联中相关试剂对抗体的影响（上图c）。

3.1.2 二乙烯基嘧啶

2019年Walsh等人利用含有两个Michael 受体的二乙烯基嘧啶与还原后的二硫键反应，并且具有较高的偶联得率。但是因为该试剂中桥接二硫键的链较长（中间跨越7个碳原子），因此反应中存在二硫化物加扰。

小结：目前已经有很多研究用单/双砜，NGM，二乙烯基嘧啶等试剂与天然抗体的二硫键进行特异性偶联，但是目前还存在很多限制和陷阱。首先，偶联过程中二硫化物的加扰不可避免，这在一定程度影响产品的功效、产量和放大生产。虽然已经有一些方法用于改善该问题，如精确的控制反应条件，增加桥接的动力学，使用TECP连接的苯硫酚衍生物进行一体化反应等，但是这些根据不同药物的具体情况进行优化。其次，在还原条件下，这些桥接试剂无法区分还原的二硫化物和有利的硫醇，这在一定限制了二硫化物桥接缺乏没有游离半胱氨酸的抗体。Wilson 等人报道了一种三价砷(As(III)) 酸衍生物作为生成的潜在解决方案。

二硫化物硫醇的正交性，因为单硫醇砷酸络合物是熵不利的。但是，这种用法未在抗体应用中证明，以及关于治疗相关抗体的体内毒性浓度问题仍需解决。最后，再桥接试剂的水溶性较差，通常需要改变助溶剂的比例以进行反应。这增加抗体变性的机会。如果是双砜试剂，这个问题可以通过使用水溶性单砜中间体来缓解，对于其它试剂可以通过额外的引入PEG 接头进行解决。  

3.2 糖基偶联

IgG型抗体中存在两个保守的糖基化位点N297，该位点位于CH2结构域，远离抗体结合抗原的功能结构域，因此利用该位点进行偶联不会对抗体的结合功能造成影响。总的来说，利用该糖位点的偶联，主要是通过在糖基上引入一个新的反应基团，然后再利用相关试剂进行定点偶联。

3.2.1基于糖基氧化的修饰

氧化裂解位于末端的顺式二醇组寡糖会产生一个醛基，一些含有氨氧基、肼或酰肼官能团的试剂可以与其发生化学反应，利用该反应可以将载荷定点偶联到抗体上。O'Shannessy 及其同事首先使用高碘酸盐氧化抗体的糖基形成醛基，然后与酰肼标记的生物素反应。类似的方法用于偶联多种分子，包括放射性标记的有机金属络合物、毒素和蛋白质/抗体。 虽然这些方法确实实现了天然抗体的位点特异性偶联，但是抗体糖基化的异质性极大地限制了该方法的适用性。此外，高浓度的高碘酸盐（10-30 mM）会导致敏感的蛋氨酸残基被氧化，可能会损害抗体的血清半衰期、完整性和功效。

为了避免这个问题，研究者引入了高碘酸敏感唾液酸进入抗体 N-聚糖（下图）。为实现特异性修饰，半乳糖和唾液酸残基被β1,4-半乳糖基转移酶(Gal T)和α2,6-唾液酸转移酶 (Sial T)酶促掺入天然抗体的寡糖上。MALDI-TOF 分析表明，超过 94% 的 N糖基残基转化为单唾液酸化的糖。使用 1 mM 高碘酸盐将唾液酸残基氧化并产生醛基，它们与氨基氧官能化细胞毒素偶联，其DAR值平均 DAR 为 1.6。虽然这些 ADC 在体外和体内具有显着的抗肿瘤功效，但是低浓度的高碘酸盐仍然会一定程度的影响FcRn 与抗体的结合。

3.2.2 基于糖基非氧化的修饰

为了完全避免高碘酸盐处理，一些研究小组通过引入具有生物正交基团的糖残基对寡糖进行了酶促修饰。博格曼等人研究表明使用 β1,4-半乳糖基转移酶突变体 GalT (Y289L) 可以将将C2 位置含有酮手柄的半乳糖掺入抗体寡糖中。然后可以在酮手柄和含氨氧基的衍生物（生物素或荧光染料）之间发生选择性结合）。然而，该过程的转化率和效率需要进一步提高。Zeglis等人应用酶介导的糖工程和菌株促进的叠氮化物-炔烃环加成反应对PSMA抗体 J591的修饰寡糖进行位点特异性放射性标记（下图）。他们使用了β1,4 -半乳糖苷酶去除末端半乳糖，然后使用GalT（Y289L）引入叠氮修饰的半乳糖作为糖基的末端残基。然后使用含有去铁胺 (DFO) 的螯合剂并使用菌株促进的叠氮化物-炔烃环加成反应连接到抗体上。最后，可以通过将螯合剂修饰的抗体与 89Zr 混合来生成 89Zr 标记的 ADC。通过这种方法产生的 89Zr 标记的抗体被肿瘤选择性吸收，并在表达 PSMA 的前列腺肿瘤的小鼠模型中表现出优异的抗肿瘤活性。

作为一种替代策略，Li 和同事使用 Gal T 重塑抗体糖基，将现有的糖型转化为 G2 糖型（图 E）。然后将在C9位置带有叠氮化物的唾液酸衍生物掺入 N-聚糖使用唾液酸转移酶 ST6GalI。随后，二苄基环辛醇 (DIBO) 修饰的生物素、荧光团或细胞毒性药物与含叠氮化物的抗体反应，形成 DAR 为 3.5-4.5 的抗体偶联物。这种糖基化重塑策略为制备具有未改变的 FcγRIIIa 结合的同源 ADC 提供了一种有吸引力的替代方案。出于药代动力学原因，为了达到较低的 DAR，van Delft 及其同事报告了一种新的化学酶偶联策略，用于生成 DAR 为 2 的 ADC（图F)。去糖基化并分别通过内切糖苷酶 Endo S2 和半乳糖基转移酶 GalT (Y289L) 引入 GalNAz 后，修饰的抗体可以通过无铜点击化学连接到有效负载上，从而产生高度稳定和均质的 ADC，其 DAR值约为 2 。

3.2.3 代谢工程化修饰抗体寡糖

除了在体外使用酶学和化学策略对抗体寡糖进行工程改造外，还可以通过使用寡糖残基的代谢工程引入含有生物正交反应基团的糖类似物来获得 ADC。Okeley 及其同事首次报道了使用岩藻糖基转移酶VIII在N-聚糖末端的岩藻糖类似物 6-硫代岩藻糖（下图）。具体来说，从在大约 200 种合成岩藻糖类似物中筛选的6-硫代岩藻糖过乙酸盐，可以以 60-70% 的效率替代抗体寡糖中的岩藻糖。随后，6-硫代岩藻糖部分通过马来酰亚胺与 MMAE 结合，产生平均 DAR 为 1.3 的ADC。与通过链间二硫键/马来酰亚胺偶联化学制备的 ADC 相比，使用该策略获得的 ADC 保持了改善的血浆稳定性和体外抗肿瘤活性。

小结：尽管在获得具有生物正交基团的糖型的 IgG方面取得了重大进展，但大多数酶介导的糖基化工程技术仍处于实验室规模的探索阶段。此外，为了产生 ADC，总是需要将一些非天然成分引入抗体聚糖中。据报道，一些经过细微修饰的聚糖在人体中具有免疫原性。因此，聚糖工程抗体偶联物的体内稳定性和免疫原性仍有待充分评估。

3.3 化学选择性修饰

从概念上讲，进行基于化学选择性直接修饰特定氨基酸残基的化学反应是修饰天然抗体的最直接方法。然而，不同亲核氨基酸反应性的微小差异使得难以实现所需的化学修饰特异性。此外，由于结构相似的抗体之间存在残基异质性，化学和区域选择性修饰方法通常仅在特定情况下有效，限制了该方法的通用性。目前一个被广泛使用的概念即通过精确控制反应 pH 值来靶向具有最低 pKa 的赖氨酸，例如，N末端胺的碱性比其他赖氨酸弱因此其可以在pH 7.7 ±0.5条件下被靶向反应。下面总结了基于化学选择性的位点特异性抗体修饰的最新发展。

3.3.1 N端转氨基

2007 年，Scheck 等人报道了使用 pyridoxal-5'-phosphate（PLP，维生素 B6）通过氨基转移反应将免疫球蛋白轻链的 N 端胺转化为酮。然后可以很容易地通过肟连接对酮进行功能化。与赖氨酸残基的其他侧链相比，碱性N-末端胺（亚胺形成）和更酸性的N-末端α-质子（互变异构）是N-末端胺化学选择性的基础。在升高的温度 (50℃) 下实现中等转化率 (47%)。基于相同的转氨机制，Witus 等人。利用 Rapoport 盐 (RS) 选择性地将免疫球蛋白重链的 N 端胺转化为酮部分，在温和得多的条件下（37℃），产率提高到67%（下图）。这些氨基转移试剂表现出一些残留偏好，如在鼠 IgG 中，PLP更喜欢轻链天冬氨酸而不是重链谷氨酰胺，而 RS 在人IgG中更偏向重链谷氨酸而不是轻链天冬氨酸。进一步的实验表明，PLP和RS的最佳反应伙伴分别是三肽 H-Ala-Lys-Thr 和 H-Glu-Glu-Ser。由于这些 N 末端序列不存在于天然抗体中，因此需要基因工程来获得最佳反应性。

3.3.2 赖氨酸特异性试剂

基于控制反应动力学、蛋白质位点特异性或靶向高反应性赖氨酸的若干尝试已用于选择性修饰某些抗体赖氨酸残基。然而，由于赖氨酸选择性的机制尚不清楚，这些方法未能实现高产率。因此，很难将它们应用于抗体或其他蛋白质的修饰。为了解决这个问题，Matos等人报道了使用基于丙烯酸磺酰酯的试剂，结合pH控制，实现了对具有最低 pKa 的单一赖氨酸的选择性和高产率 (>95%) 的修饰（下图）。磺酰基氧通过椅子状过渡态加成到双键稳定了胺产生的正电荷。极性较小的半胱氨酸 S-H基团减少了氢键相互作用，从而解释了赖氨酸对半胱氨酸的化学选择性。区域选择性主要基于pKa控制，因为具有最低 pKa的赖氨酸最有可能在中性至微碱性条件下具有反应性。用丙烯酸酯修饰的赖氨酸残基可以通过氮杂-迈克尔加成进一步与含胺化合物结合。这种修饰策略的普遍性已用五种模型蛋白成功证明，包括人源化全长曲妥珠单抗抗体。流式实验证明，用抗癌药物克唑替尼进行位点特异性修饰后，曲妥珠单抗对人 HER2 的结合亲和力和特异性不受影响。但是，如果修饰的赖氨酸对抗体功能至关重要，那么偶联可能会失败。

3.3.3 关键点定向修改

Adusumalli 等人开发了另一种基于反应性的方法，称为关键定向修饰 (LDM)。LDM利用快速且可逆的胺反应基团来引导环氧基团和蛋白质组氨酸残基之间缓慢的不可逆反应（下图）。虽然对羟基苯甲醛与赖氨酸残基建立了快速的开关平衡，但连接的环氧化物部分只会与位于赖氨酸残基一定距离内的组氨酸反应。在组氨酸和环氧化物之间发生不可逆连接后，游离醛可以进行肟连接以偶联其他感兴趣的分子。两种 ADC，曲妥珠单抗-多柔比星和曲妥珠单抗-emtansine，已使用该技术制成，并且在体外具有抗肿瘤活性。为了扩大 LDM 的底物范围，Adusumalli等人报道了另一种用于修饰赖氨酸而不是组氨酸的 LDM 试剂。将中等离去基团从环氧化物转换为 2,6-dibromo-4-(morpholine-4-羰基）苯酚酯，为优化底物提供了更多选择。

小结：基于化学选择性的直接抗体标记是最方便的抗体修饰策略。在初始反应中只需要一种试剂来引入生物正交手柄，然后即可将载荷连接到抗体上。修饰的特定位点由抗体的内在特性和3D结构决定。在某些情况下，这种从抗体到抗体的变异性可能会导致产量降低或抗体功能受损。

3.4 基于邻近偶联

另一种用于实现对天然抗体分子进行位点特异性偶联的新兴策略是利用邻近效应将交联反应物或催化剂引导至所需氨基酸残基。目前已经有研究者利进行选择性共价键的反应。

3.4.1 关键点定向修改

由于光交联在不同化学环境中的多功能性，光交联被用于对天然抗体进行位点特异性标记。苯甲酰苯丙氨酸 (Bpa) 是一种紫外线诱导的交联氨基酸，已广泛用于绘制蛋白质相互作用的图谱。在紫外线照射下（