我养了三种贴壁的细胞，用同样的消化方法，都很好。这三种细胞是A549，ECV304，2BS。

1、0.25%胰酶新鲜解冻,不需要预热。

2、倒掉培养瓶中的培养基,并用预冷的D-Hank‘s洗两次（要冷，用前4度中取出）。

3、加入约1-2ml的胰酶,晃动瓶子,使液体浸润瓶底。

4、超净台上放置约1-2分钟（2BS需要的时间更短，约1分钟）

5、镜下观察（我一般都省略了，因为每次的效果都很好）,见细胞变圆或细胞间隙变大,即可加入含血清的培养基终止消化。（我们的胰酶都不去掉）

6、从瓶口到瓶底吹打，可见细胞层脱落（那时能真正的理解什么是cell sheet）。

7、收集离心。稀释,分瓶接种 。

失败的经历：胰酶提前两天解冻，并于培养箱中放置了15分钟左右，消化时间为5分钟，我觉得时间太长了，就加了培养基终止消化。结果吹打了我十多分钟，还有很多没有吹下来。后来改成了直接解冻，不预热的方法。效果反倒好了。

分析原因：解冻时间过长？

心得：胰酶有时候的确可以不预热的。