NGS020 测序数据量估算 |
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1.单端测序
数据量=reads长度 × reads个数 2.双端测序数据量=单端reads长度 × 单端reads个数 * 2 通常测序数据量的单位都是用“G"表示，例如1G表示10亿个碱基，换算关系为1Gb = 10^3 Mb = 10^6 Kb = 10^9 Base（注意此处的单位与数据存储单位进行区分） 此外，测序数据量还有另外一种表示方式，即cluster。一个cluster表示一个DNA片段。比如说某一个样本测序数据量为30M 的 cluster，如果采用双端测序技术，每个cluster从两端都测一次，每次测150bp, 所以就会得到30M×2=60M的reads数，则测序数据量即为60M×150=9G的碱基数。 3.测序深度（Sequencing depth）是指测序得到的碱基总量（bp）与目标基因组大小的比值，即测序深度=数据量大小 / 目标基因组大小。或者理解为目标基因组区间内中每个碱基被测序到的平均次数，如测序数据量为1G，测序的基因组大小为1M，那么测序深度为1G/1M=1000×。 4.测序覆盖度（Sequencing coverage）是指测序获得的序列占整个基因组的比例。或者可以理解为目标基因组上至少被检测到1次的区域（或者是碱基），占整个基因组的比例。 由于基因组中的高GC、重复序列等复杂结构的存在，测序最终拼接组装获得的序列往往无法覆盖有所的区域，这部分没有获得的区域就称为Gap。例如一个细菌基因组测序，覆盖度是98%，那么还有2%的序列区域是没有通过测序获得的。 测序深度与基因组覆盖度之间是一个正相关的关系，测序带来的错误率或假阳性结果会随着测序深度的提升而下降。 测序深度和覆盖度的示意图如下 测序深度及覆盖度 我们的期望是基因组上每个碱基至少被测序到3次（对SNP检测来说，一个位点至少要大于3次，才被认为有效）的概率大于0.99。那么多大的测序深度，才能满足基因组中每个碱基被测序到3次的概率大于0.99。 假设基因组大小为G, 假定每次测序可从基因组任何位置上随机检测一个碱基。那么对于基因组上某一个固定碱基位置，在一次测序（每测一个碱基为一次测序）中，该位置被命中的概率为P （P=1/G）。由于基因组 DNA 很长，在一次测序中每个碱基被检测到的概率很小。如测序量为10G时，即进行10^9次测序过程，每个碱基被检测到的次数会显著增加。我们知道，当某事件出现的概率很小，而试验次数N很大时，该事件符合泊松分布。泊松分布是一种离散型随机变量的分布,它有一个特殊的性质即期望和方差均为λ。泊松分布的概率由参数λ所确定，N次试验中出现 x 次的概率为 泊松分布 在实际应用中， 对于所观察的稀有事件，我们先利用样本数据计算出平均值并用它来估计 λ。由于测序深度就是每个碱基被检测到的平均次数，因此可以看作成λ。根据这个公式，我们把x看作特定碱基被测到的次数，λ看作基因组的测序深度。在测序深度为10的情况下，根据公式 P(0)=e^(- λ)=e(-10)=4.5e(-05),几乎不太可能测不到。一个碱基至少被测到一次的概率为1-P(0)≈1。一个碱基至少被测到3次的概率为 1-P( 0)－P( 1) - P( 2) ＞0.99。 image.png 从图1可以看出，10X的测序深度，能够满足基本的实验目的。 因此只要确定了测序深度，测序数据量就很好计算了。数据量大小=测序深度*基因组大小。 REFBentley D R, Balasubramanian S, Swerdlow H, et al. Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry.[J]. Nature, 2008, 456(7218): 53-59. |
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