小鼠MCAO线栓的制作（原创） |
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小鼠MCAO线栓的制作线栓制作的好坏是模型成功的关键，下面是我做线栓的方法和体会：1、选材 尼龙线或鱼线 1）文献报道尼龙线多用5-0还有用4-0或6-0的，我没有用过就不多说了。 2）鱼线，直径为0.104mm和0.128mm的。我还买过0.090mm和0.142mm，感觉前两种就可以解决问题了，因为小鼠体重变化相对较小。下图是包裹好的0.128mm、0.090mm、0.104mm三种型号的鱼线 screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=640 height=399 title="Click to view full IMG_8244.JPG (1073 X 670)" border=0 align=absmiddle>2、线段的切割 需要在显微镜下进行 我认为这不很重要，对能不能包裹出理想的线栓起到关键的作用。 1）先用剪刀把鱼线剪成2cm长的线段； 开始时我做完这步就进行包裹，包裹出来的线栓大多不理想；仔细研究后，发现主要是因为线栓的头端不圆，形状不规则造成的。包裹好线栓的前提是线栓头端不能有任何变形，与原鱼线一致，才能保证包裹出的线栓型号统一，粗细一致。因为包裹材料是在均匀包物体表面的，如基础不规则，想包出理想线栓可能太小了。下面是我解决的办法。 2）显微镜下切割 所需的器械：显微镜、显微镊子一把、刀片（那种只有一面刀刃且平直， 刀背很厚的）、止血钳一把、还有非常平的平面（我用的塑料培养皿底）。操作：将已经剪好的线段移到显微镜下的培养皿内放平，用显微镊子固定，取 止血钳夹刀片，显微镜直视下垂直线端平面和水平面切下，显微镜下观察头端是否正圆，不满意再次切割。我认为这不很重要多打个不字。3、线栓的标记这步对插线是很有帮助的。他能使线栓顺利进入颈外内，并为避免进入翼颚动脉提供指示，还能帮助确定插入深度。1）材料: （粗一点的）、直尺、显微镊子一把、白纸和笔2）操作：在白纸上画好如图每个宽0.5cm 将图放到纸的中心，把线栓用镊子放的格子上，镊子固定，用黑色maker 笔在1-1.5cm出标记（没有特殊要求），头端标记。3）头端标记：头端标记时要小，便于插线时观察位置；头端标记时要包全，不能只在一面上色，因为这能造成包裹的不均匀；不能有大的碳粒子，影响包裹效果。 新建 Microsoft Word 文档.doc (19.0k) 4、[color=color]线栓包裹[color]1）线栓的干燥和冷却 干燥 ： 线栓标记好后，放到通风处或日光灯下充分干燥，这样包裹时不会掉色，实石蜡脱落。 冷却：冻一块冰（我用的是大培养瓶），将干燥好的线栓放到上面（线栓是装到培养皿中的），在培养皿和培养瓶之间放一块湿纱布。为什么要有这一步哪?因为石蜡融化后变成固体要较低的温度，温度越低凝固越快，这时的线栓的温度在0度左右，轻蘸一下包裹的就比较好。2）[color=color]石蜡的融化[color] 融化：尽量用广口、浅底的器皿（我用的是消毒用白缸盖），将一块石蜡完全融化。冷却：完全融化后，将酒精灯移到缸盖的一角，远离火焰的石蜡慢慢凝固，最后有一个固体和液体的交界面，我们就用此地3)包裹：要在显微镜下进行材料：显微镊子两把操作：将冰块上线栓镊子夹好，显微镜下在交界面蘸一下，不要太快。镜下观察包裹情况，满意后收好；不满意，如包的少可一在 交界面迅速的蘸一下在观察；如包的多，可以在热石蜡中蘸一下，石蜡脱掉后放回冰块上。下图是包裹好的 （缩略图，点击图片链接看原图）4、[color=color]消毒和保存[color]1）消毒：包裹好的线栓药用低温消毒或戊二醛熏蒸消毒。千万不要用酒精，因为maker 的标记就掉了2）保存：文献上多用盐水，我用的蒸馏水，因为盐水时间长有盐析出，很不爽。5、[color=color]最后筛选[color]取一只30g的小鼠（这只就让他奉献了吧!），解剖好后，将每根制作好的线栓都插入进去，顺利的留下，插不进去的或太细的丢弃。这是不是太麻烦了，为了保证正式实验时的成功、准确 、顺利这样做非常有必要。做这些工作费不了很多时间，真正费时的是模型不成功反复摸索的时间。在两个图 screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=639 height=349 title="Click to view full IMG_8246.JPG (1166 X 636)" border=0 align=absmiddle>成功小鼠 （缩略图，点击图片链接看原图）成功小鼠 （缩略图，点击图片链接看原图）成功小鼠 （缩略图，点击图片链接看原图）好家伙，！学习了顺便问一句，楼主的小鼠生活环境怎样，是普通级的还是spf级的，垫料，食物，水需要消毒么？普通级的小鼠 ，在动物室饲养，术后注意保温。垫料，食物，水没有需要消毒。术后保温保多久呢，像我做大鼠一般都是术后白炙灯下照，醒了以后就不保温了，不知你们小鼠是怎么做的呢？从手术时开始到麻醉完全清醒，一般在2-4小时左右。以小鼠可以活动为标准。但我是在夏天做的，室温都在20度以上，温度要求相对低一些，如果室温低的话，一定是小鼠温度达到30度以上。无论是对小鼠的存活还是对模型的稳定都很重要。还想请问一下，你们是用什么品系的小鼠呢，是balb/c还是昆明小鼠呢昆明小鼠很感谢楼主的回复。我已经在用昆明小鼠做了。还想请教几个问题：1. 就是你在做这个模型之后，小鼠一般出不出现horner征呢，因为我看见你上面发的帖子里，最后一张图，小鼠向对侧弯曲，但是同侧的眼睛是睁着的，也就是没有horner征。可是我分离到颈外动脉及插管都还好，但是一分离到翼腭动脉的时候就很容易损伤到周围的交感神经。即便将颈外向右下方牵拉，线栓还是很容易进入翼腭动脉，不知你是怎么做的呢？ 2. 还有你是否会觉得石蜡包裹的头端在插进插出后石蜡容易掉啊。 3. 我做的几只，发现小鼠在缺血2个小时的时候苏醒，症状会很明显，可是再灌几个小时以后，症状就慢慢减弱，第二天就消失了。 保温可以放到电热毯上面实现。线头可以不用石蜡处理，我用的是704硅橡胶。在化工商店买的，类似牙膏的包装。先将线在肥皂水里洗，除掉表面油。然后粘上硅胶，很快就可以干，可以作成各种形状。在血管里反复进出都不会掉。呵呵，谢谢楼上的提醒，我打算也试试。还有像你们做小鼠模型，术前需不需要禁食12小时呢。我做的模型术后可以存活好几天，也有典型症状，但是就是不进食，结果是饿死了。绝对是没有损伤迷走神经的。hys wrote:很感谢楼主的回复。我已经在用昆明小鼠做了。还想请教几个问题：1. 就是你在做这个模型之后，小鼠一般出不出现horner征呢，因为我看见你上面发的帖子里，最后一张图，小鼠向对侧弯曲，但是同侧的眼睛是睁着的，也就是没有horner征。可是我分离到颈外动脉及插管都还好，但是一分离到翼腭动脉的时候就很容易损伤到周围的交感神经。即便将颈外向右下方牵拉，线栓还是很容易进入翼腭动脉，不知你是怎么做的呢？2. 还有你是否会觉得石蜡包裹的头端在插进插出后石蜡容易掉啊。3. 我做的几只，发现小鼠在缺血2个小时的时候苏醒，症状会很明显，可是再灌几个小时以后，症状就慢慢减弱，第二天就消失了。 由于最近很忙才给你回话，首先向你表达歉意。1.我练习模型用了3个月时间，初期成功的很少，成功的下腔出血的几率也很大。后期我基本不分离翼腭动脉，具体操作请见我的上一片帖子。上一篇贴的连接 > 这里我在简单的说一下。练习很重要，境内动脉只是分离很短的一段，不超过1厘米。线栓有一个自然的弯曲度，使他指向上，将离断的颈外拉向后下，与境内方向大体一至，但要更向下一些，插线时进入境内后使线栓头的方向向上向内，后期我基本上都能保证一次成功。多实践，慢慢的体会我相信这不是问题，你一定会很快掌握的。还有我从经总动脉也插过，效果基本一样，并且不用分离境外，能省一点时间。 2.我用的效果都很好，有的用了几次也没问题，最多的用过5次。但要注意不要用酒精，因为记号笔的黑色就褪掉了，并且这时头部的石蜡冶容易掉。 3.原因我考虑可能1，模型没成功；2，下腔出血可能；3，其他如，阻塞不全等。我建议你取闹看一看，我是在反复的作模型，取闹，总结，调整线栓的长度和头部的直径后，慢慢熟练的。 hys wrote:还有像你们做小鼠模型，术前需不需要禁食12小时呢。我做的模型术后可以存活好几天，也有典型症状，但是就是不进食，结果是饿死了。绝对是没有损伤迷走神经的。我做的时候基本多时禁食一夜，第二天早晨做，进食情况是很差，有的树后一天能掉3－5克，可以用混合乳或者牛奶灌胃，用注射和头皮针去掉针头，这样保证存活每太大问题。真是十分感谢楼主的回复。可以这么说，如果没有楼主当初的关于小鼠的帖子，我现在也不可能做得到。到目前为止练了40来只昆明小鼠，现在小鼠的状态比当初好得多，可以自由活动，3天以上不成问题，就是不怎么吃东西。也打算以后再用牛奶灌灌胃。 翼腭的问题，我后来经过仔细解剖，发现翼腭的走向是偏后下方，与颈内的内上方是有明显区别的，就像你所说的，控制一下插线的角度和线栓弯曲的方向是很容易进去的，不过我现在感觉还不是很好，大概70%是一次插进去的，还有的则要反复调整进线的角度。horner征在最近做的十来只大部分都没有了。不过奇怪的是同侧的眼睛倒还好，对侧的眼睛倒是分泌物很多，眼睑都粘住了，怪怪的。不知是什么缘故。 线栓是用园子里有人出售的0.16mm的尼龙线栓，感觉适用于30g以上的小鼠，30g以下的往往插不进去。 上传一副我今天刚取脑的数码照片。以前别人说SAH肯定会在24小时内死亡，可是今天我在MCAO术后72小时取脑，却发现颈内动脉在发出MCA之前的一段有少量淤血（图中箭头所指处），不过梗死体积还是有的。不知这种模型还能要吗？ screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=640 height=480 title="Click to view full IMG_0654 4.jpg (1024 X 768)" border=0 align=absmiddle>hys wrote:真是十分感谢楼主的回复。可以这么说，如果没有楼主当初的关于小鼠的帖子，我现在也不可能做得到。到目前为止练了40来只昆明小鼠，现在小鼠的状态比当初好得多，可以自由活动，3天以上不成问题，就是不怎么吃东西。也打算以后再用牛奶灌灌胃。 翼腭的问题，我后来经过仔细解剖，发现翼腭的走向是偏后下方，与颈内的内上方是有明显区别的，就像你所说的，控制一下插线的角度和线栓弯曲的方向是很容易进去的，不过我现在感觉还不是很好，大概70%是一次插进去的，还有的则要反复调整进线的角度。horner征在最近做的十来只大部分都没有了。不过奇怪的是同侧的眼睛倒还好，对侧的眼睛倒是分泌物很多，眼睑都粘住了，怪怪的。不知是什么缘故。 线栓是用园子里有人出售的0.16mm的尼龙线栓，感觉适用于30g以上的小鼠，30g以下的往往插不进去。 关于眼睛的分泌物，我做的时候也有出现的，本人觉得但没查资料：主要是1、梗塞得体积和部位有关，2、与模型制作时损伤颈部的神经有关，3、40来只昆明小鼠的数量还有点少，不知道你的用时是多少，我建议怎么也的在15分钟内完成，这样才更有意义，不然就很难排除是什么因素起的作用。不知这种模型还能要吗？这种模型最好不要，因为下腔出血和缺血梗塞有区别。开始的时候我也觉得有些可惜，但后来成功的多了，也就无所谓了。你的片子我看到了，提一个不成熟的建议：先要想到你想发表文章时需要什么样的图片，按那个标准来拍照，并且标准一定要统一。还要想到光线、底版和下一步计算的问题等等。本人的个人意见，不当处请包含。如对你有些许启发，幸甚至哉！ qu_jing_dong wrote:不知这种模型还能要吗？这种模型最好不要，因为下腔出血和缺血梗塞有区别。开始的时候我也觉得有些可惜，但后来成功的多了，也就无所谓了。你的片子我看到了，提一个不成熟的建议：先要想到你想发表文章时需要什么样的图片，按那个标准来拍照，并且标准一定要统一。还要想到光线、底版和下一步计算的问题等等。本人的个人意见，不当处请包含。如对你有些许启发，幸甚至哉！ 谢谢你的指点，对我来说真的很有用。其实那个线栓显微镜下看，线头还是烧得满圆钝的（什么时候上传副线栓的显微镜照片），不知为什么还会出现蛛网膜下腔出血。而且我都是控制进线深度在超过颈总动脉分叉处1cm左右，不管前面有无阻力都不再插了。还有的更奇怪，出现侧脑室出血。真不知这种脑梗死模型，梗死本身会不会导致梗死后出血呢。 现在做模型的时间还无法达到15分钟，如果从切皮开始算起，大概短的20来分钟，长的要半个小时。如果插线顺的话就很快，要不就得插半天。 要进一步加强练习，一定要达到15分钟以内；并且操作一定要轻柔，慢慢的会练出手感的；1cm尽量不要超过颈总动脉分叉处，是在血管松弛状态下；一般来说梗死本身不会导致梗死后出血，因为小鼠的血管本身很细，并且鼠的凝血机制很好，我想主要原因还是血管破了的缘故。还有就是刚开始我也做过石蜡包被的线栓，可是显微镜下看，头端总是粗细不均，很难做到均匀一致，虽然我也是在石蜡融化和固化的交界面沾的，可是效果总是不太好，要么就是只沾上薄薄的一层，几乎看不到石蜡，要么就是沾得变了形。不知你用的石蜡是什么样熔点温度的呢。还有不知你有无考虑过，2小时的缺血时间中间，小鼠会醒，脑袋会到处转，线栓会不会在血管内移位甚至挫破血管引起蛛网膜下腔出血呢。我现在用的线栓0.16mm，头端直径不超过0.22mm，30g以上缺血1小时，缺血时就用一块湿纱布覆盖伤口，1小时后拔线，好像也可以。 还有就是像你线栓包被的头端一定要有一定长度么（像有的文献上讲4mm），能不能够只是尖端沾一点点，反正保证其圆钝就可以了，然后就是线栓本身的直径达到一定的粗细一样可以起到完全堵塞MCA的起始部。hys wrote:还有就是刚开始我也做过石蜡包被的线栓，可是显微镜下看，头端总是粗细不均，很难做到均匀一致，虽然我也是在石蜡融化和固化的交界面沾的，可是效果总是不太好，要么就是只沾上薄薄的一层，几乎看不到石蜡，要么就是沾得变了形。不知你用的石蜡是什么样熔点温度的呢。还有不知你有无考虑过，2小时的缺血时间中间，小鼠会醒，脑袋会到处转，线栓会不会在血管内移位甚至挫破血管引起蛛网膜下腔出血呢。我现在用的线栓0.16mm，头端直径不超过0.22mm，30g以上缺血1小时，缺血时就用一块湿纱布覆盖伤口，1小时后拔线，好像也可以。 1.熔点温度为50多度，我包的线拴头用黑色标记笔均匀涂抹了碳，还有降温，上面说到了。并且开始在石蜡都融化后，把酒精灯移到容器一角，石蜡慢慢凝固的过程中的交界面上，要把握好时机。2、我的作法是把线拴剪短放到胸锁乳突肌下，十分稳定，一般不会出现你说的情况；我一般采取二次麻醉。如果你说的可以，并且避免麻醉，那是最好不过的了。hys wrote:还有就是像你线栓包被的头端一定要有一定长度么（像有的文献上讲4mm），能不能够只是尖端沾一点点，反正保证其圆钝就可以了，然后就是线栓本身的直径达到一定的粗细一样可以起到完全堵塞MCA的起始部。1.关于线栓包被的头端一定要有一定长度的问题有文献参考，最好有一等的长度，这样可以避免只阻断了大脑前动脉的血流而使有部分的血液灌注到大脑中动脉内，园子里有这样的图例，并且你可以搜到相关的文献。而实际上各家说法不一。2.关于尖端沾一点点，反正保证其圆钝就可以了，这个我也想到了，也作了一定的尝试，但是沾一点反而较一段难，并且还容易脱落。后来，一上午做的线拴，并按我说的方法筛选，至少有七八十合格的。之所以不买，一个是经济原因，在一个线拴的粗细可以自己调整，很方便。想问一下，你的另一篇帖子里，那个脑梗死染色的照片是术后第几天染的色啊，因为我觉得跟我术后72小时染色的体积相比小很多，不知是不是与线栓的粗细有关。是术后24h的，不过固定的时间长了，颜色不鲜艳了。并且是用药组，所以梗塞体积小一些。哦，是这样啊。多谢你上述提的那些建议，我打算再做一批动物等手术比较成熟后再开始正式模型。最近作动物，感觉很奇怪，有一批动物是脑实质出血，就是线栓已经进入颅内了，可是偏偏只有7~8mm左右就感觉到阻力，然后轻轻尝试进线也进得进去，结果术后不到一天老鼠还是死了，解剖一看居然是脑实质出血，大半个右脑半球都是血，因为线是买的，因此进入颅内以后我觉得似乎就没法再改变什么了。出现这样的情况真是郁闷，不知是不是不同的小鼠生理解剖的差异所致。 |
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