《第三章基因工程的常规技术.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第三章基因工程的常规技术.ppt（144页珍藏版）》请在一课资料网上搜索。

1、1第三章第三章 基因工程的常规技术基因工程的常规技术第一节第一节 凝胶电泳技术凝胶电泳技术第二节第二节 分子杂交技术分子杂交技术第三节第三节 PCR技术技术第四节第四节 生物芯片生物芯片第五节第五节 基因文库构建基因文库构建第六节第六节 酵母双杂交系统酵母双杂交系统第七节第七节 DNA测序测序2第一节第一节 凝胶电泳技术凝胶电泳技术 什么是电泳技术？什么是电泳技术？ 电泳法，是指带电荷的供试品（蛋白质、电泳法，是指带电荷的供试品（蛋白质、核苷酸等）在核苷酸等）在惰性支持介质惰性支持介质（如纸、醋酸纤（如纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等）中，维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等）中，于

2、电场的作用下，向其对应的电极方向按各于电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的速度进行泳动，使组分分离成狭窄的区自的速度进行泳动，使组分分离成狭窄的区带，用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱带，用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其百分含量的方法。或计算其百分含量的方法。3琼脂糖与琼脂有琼脂糖与琼脂有区别么？区别么？456琼脂糖凝胶电泳特点琼脂糖凝胶电泳特点7琼脂糖凝胶的配置琼脂糖凝胶的配置1.1. 根据电泳需要，配置合适浓度的电泳及制根据电泳需要，配置合适浓度的电泳及制胶缓冲液。一般为胶缓冲液。一般为 1 1 TAE TAE或或0.50.5TBETBE。注意：用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓

3、冲液必须是相注意：用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必须是相同的。同的。2.2. 根据制胶量及凝胶浓度，在加有一定量的根据制胶量及凝胶浓度，在加有一定量的电泳缓冲液的三角锥瓶中，加入准确称量的电泳缓冲液的三角锥瓶中，加入准确称量的琼脂糖粉。琼脂糖粉。 注意：总液体量不宜超过三角锥瓶的注意：总液体量不宜超过三角锥瓶的50%50%容量。容量。3. 3. 在微波炉中加热溶解琼脂糖在微波炉中加热溶解琼脂糖注意：必须保证琼脂糖充分完全溶解，否则，会造成电注意：必须保证琼脂糖充分完全溶解，否则，会造成电泳图像模糊不清。加热时如胶液剧烈沸腾发泡，停止加泳图像模糊不清。加热时如胶液剧烈沸腾发泡，停止加热。微波

4、炉中加热时间不宜过长。热。微波炉中加热时间不宜过长。8琼脂糖凝胶的配置琼脂糖凝胶的配置3.3. 使溶液冷却至使溶液冷却至6060左右，如需要可在此时加左右，如需要可在此时加入溴化乙锭入溴化乙锭(EB)(EB)溶液使其终浓度为溶液使其终浓度为0.5ug/ml0.5ug/ml，并，并充分混匀充分混匀不提倡使用。不提倡使用。注意：溴化乙锭是一种致癌物质。使用含有溴化乙锭的注意：溴化乙锭是一种致癌物质。使用含有溴化乙锭的溶液时，请戴用手套。溴化乙锭在可见光下会分解。溶液时，请戴用手套。溴化乙锭在可见光下会分解。5. 5. 将琼脂糖溶液倒入制胶模中，然后在适当位将琼脂糖溶液倒入制胶模中，然后在适当位置处

5、插上梳子。凝胶厚度一般在置处插上梳子。凝胶厚度一般在3 35 mm 5 mm 之间。之间。 注意：不要产生气泡，溶液温度太高注意：不要产生气泡，溶液温度太高(60)(60)，会使得，会使得水分过分蒸发，改变凝胶离子浓度，影响电泳效果。水分过分蒸发，改变凝胶离子浓度，影响电泳效果。6. 6. 在室温下使胶凝固（大约在室温下使胶凝固（大约30 30 分钟），然后放分钟），然后放置于电泳槽中进行电泳。置于电泳槽中进行电泳。注意：注意： 凝胶不立即使用时，用保鲜膜将凝胶包好在凝胶不立即使用时，用保鲜膜将凝胶包好在44下保存，或者放在制胶的缓冲液中，一般可保存下保存，或者放在制胶的缓冲液中，一般可保存2

6、 25 5 天。天。9琼脂糖凝胶缓冲液琼脂糖凝胶缓冲液有几种缓冲液适用于天然双链有几种缓冲液适用于天然双链DNA的电泳的电泳Tris-乙酸盐和乙酸盐和EDTA缓冲液（缓冲液（pH8.0,TAE，也，也称为称为E缓冲液）缓冲液）Tris-硼酸盐缓冲液硼酸盐缓冲液(TBE)Tris-磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液(TPE)10琼脂糖凝胶缓冲液11琼脂糖凝胶缓冲液琼脂糖凝胶缓冲液TBE可以使用可以使用10次左右，而次左右，而TAE用用23次就要更换。电泳次就要更换。电泳缓冲液多次使用后，离子强度缓冲液多次使用后，离子强度降低，降低，pH值上升，缓冲性能值上升，缓冲性能下降，可能使下降，可能使DNA条带模糊

7、或条带模糊或不规则不规则DNA带迁移。带迁移。电泳缓冲液刚好没过凝胶电泳缓冲液刚好没过凝胶1mm1mm为好，太多则电流加大，凝为好，太多则电流加大，凝胶发热。胶发热。12琼脂糖凝胶载样缓冲液琼脂糖凝胶载样缓冲液载样缓冲液是上样时与样品一起加入泳道载样缓冲液是上样时与样品一起加入泳道的。载样缓冲液有三个作用：的。载样缓冲液有三个作用：增加样品密度以保证增加样品密度以保证DNADNA沉入加样孔内；沉入加样孔内；使样品带有颜色便于上样操作；使样品带有颜色便于上样操作；其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率向其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率向阳极迁移。阳极迁移。上样缓冲液有几种，但基本都包括溴酚

8、蓝上样缓冲液有几种，但基本都包括溴酚蓝和二甲苯氰和二甲苯氰FFFF。13琼脂糖凝胶载样缓冲液琼脂糖凝胶载样缓冲液溴酚蓝在琼脂糖凝胶中迁移速率是二甲苯溴酚蓝在琼脂糖凝胶中迁移速率是二甲苯氰氰FFFF的的2.22.2倍，这一特性与琼脂糖凝胶的浓倍，这一特性与琼脂糖凝胶的浓度无关；度无关；在在0.50.5TBETBE琼脂糖凝胶电泳中溴酚蓝的速琼脂糖凝胶电泳中溴酚蓝的速率约与长约率约与长约300300bpbp的线性双链的线性双链DNADNA相同，而相同，而二甲苯氰二甲苯氰FFFF约与长约与长4kb4kb的的DNADNA相同。在相同。在0.5%-0.5%-1.4%1.4%浓度的琼脂糖凝胶中基本不会变化。

9、浓度的琼脂糖凝胶中基本不会变化。14琼脂糖凝胶载样缓冲液琼脂糖凝胶载样缓冲液15影响电泳迁移率的因素影响电泳迁移率的因素DNADNA分子的大小分子的大小1 1凝胶的浓度凝胶的浓度2 2DNADNA的构象的构象3 3使用的电压使用的电压4 4琼脂糖的种类琼脂糖的种类5 5电泳缓冲液电泳缓冲液6 6嵌入染料的存在嵌入染料的存在7 716影响电泳迁移率的因素影响电泳迁移率的因素DNADNA分子的大小分子的大小1 1凝胶的浓度凝胶的浓度2 2DNADNA的构象的构象3 3使用的电压使用的电压4 4琼脂糖的种类琼脂糖的种类5 5电泳缓冲液电泳缓冲液6 6嵌入染料的存在嵌入染料的存在7 7DNADNA分子

10、大小迁移速率分子大小迁移速率U U与与logNlogN成反比（成反比（N N为碱为碱基对数目）。分子越大，摩擦阻力越大，同时大基对数目）。分子越大，摩擦阻力越大，同时大分子通过凝胶孔径的效率也低于较小的分子，所分子通过凝胶孔径的效率也低于较小的分子，所以分子大的迁移慢。以分子大的迁移慢。等量的空间结构，紧密的电泳快（超螺旋等量的空间结构，紧密的电泳快（超螺旋 线线性性DNADNA）一般来说，分子带的电荷量越大、直径越小、一般来说，分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快。形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快。17影响电泳迁移率的因素影响电泳迁移率的因素DNADNA分子

11、的大小分子的大小1 1凝胶的浓度凝胶的浓度2 2DNADNA的构象的构象3 3使用的电压使用的电压4 4琼脂糖的种类琼脂糖的种类5 5电泳缓冲液电泳缓冲液6 6嵌入染料的存在嵌入染料的存在7 7简言之，浓度越大，分子孔径就越小，简言之，浓度越大，分子孔径就越小，DNADNA迁迁移速率就越低，反之迁移速率就大。移速率就越低，反之迁移速率就大。另外，浓度也跟凝胶的分辨率有关，浓度越大，另外，浓度也跟凝胶的分辨率有关，浓度越大，分辨率越高，但分离的片段就越小。分辨率越高，但分离的片段就越小。18琼脂糖凝胶的浓度琼脂糖凝胶的浓度19影响电泳迁移率的因素影响电泳迁移率的因素DNADNA分子的大小分子的大

12、小1 1凝胶的浓度凝胶的浓度2 2DNADNA的构象的构象3 3使用的电压使用的电压4 4琼脂糖的种类琼脂糖的种类5 5电泳缓冲液电泳缓冲液6 6嵌入染料的存在嵌入染料的存在7 7一般迁移速率超螺旋环状一般迁移速率超螺旋环状 线状线状DNADNA单链开环。单链开环。20影响电泳迁移率的因素影响电泳迁移率的因素DNADNA分子的大小分子的大小1 1凝胶的浓度凝胶的浓度2 2DNADNA的构象的构象3 3使用的电压使用的电压4 4琼脂糖的种类琼脂糖的种类5 5电泳缓冲液电泳缓冲液6 6嵌入染料的存在嵌入染料的存在7 7 低电压时，线状低电压时，线状DNADNA片段的迁移速率与所加电片段的迁移速率与

13、所加电压成正比。使分辨效果好，凝胶上所加电压不应超压成正比。使分辨效果好，凝胶上所加电压不应超过过5-8V/cm5-8V/cm21影响电泳迁移率的因素影响电泳迁移率的因素DNADNA分子的大小分子的大小1 1凝胶的浓度凝胶的浓度2 2DNADNA的构象的构象3 3使用的电压使用的电压4 4琼脂糖的种类琼脂糖的种类5 5电泳缓冲液电泳缓冲液6 6嵌入染料的存在嵌入染料的存在7 7 包括标准琼脂糖和低熔点琼脂糖以及正在研包括标准琼脂糖和低熔点琼脂糖以及正在研制的介于二者之间的琼脂糖。其分辨率等各有不同。制的介于二者之间的琼脂糖。其分辨率等各有不同。22琼脂糖凝胶的浓度琼脂糖凝胶的浓度23影响电泳迁

14、移率的因素影响电泳迁移率的因素DNADNA分子的大小分子的大小1 1凝胶的浓度凝胶的浓度2 2DNADNA的构象的构象3 3使用的电压使用的电压4 4琼脂糖的种类琼脂糖的种类5 5电泳缓冲液电泳缓冲液6 6嵌入染料的存在嵌入染料的存在7 7溶液溶液pHpH值距离其等电点愈远，其所带净电荷量值距离其等电点愈远，其所带净电荷量就越大，电泳的速度也就越大，尤其对于蛋白质就越大，电泳的速度也就越大，尤其对于蛋白质等两性分子，缓冲液等两性分子，缓冲液pHpH还会影响到其电泳方向还会影响到其电泳方向; ;溶液的离子强度过低，会使电导率降低，溶液的离子强度过低，会使电导率降低，DNADNA不是全然不动就是迁

15、移极慢；而离子过强时，电不是全然不动就是迁移极慢；而离子过强时，电导率上升，会产生大量热能，使凝胶变化甚至熔导率上升，会产生大量热能，使凝胶变化甚至熔化，也会使化，也会使DNADNA变性。变性。24影响电泳迁移率的因素影响电泳迁移率的因素DNADNA分子的大小分子的大小1 1凝胶的浓度凝胶的浓度2 2DNADNA的构象的构象3 3使用的电压使用的电压4 4琼脂糖的种类琼脂糖的种类5 5电泳缓冲液电泳缓冲液6 6嵌入染料的存在嵌入染料的存在7 7染色剂溴化乙锭插入双链染色剂溴化乙锭插入双链DNADNA造成其负电荷减少、造成其负电荷减少、刚性和长度增加，因此，线性刚性和长度增加，因此，线性DNA-

16、DNA-染料复合物在凝染料复合物在凝胶中的迁移率约降低胶中的迁移率约降低15%15%。25 在电场的作用下，在电场的作用下，带有带有负电荷的负电荷的DNA或或RNA核苷酸链，依靠核苷酸链，依靠无反应活性的稳定的无反应活性的稳定的介质（琼脂糖凝胶和介质（琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶）和聚丙烯酰胺凝胶）和缓冲液，以一定的迁缓冲液，以一定的迁移率从负极移向正极。移率从负极移向正极。根据核酸分子大小不根据核酸分子大小不同、构型或形状的差同、构型或形状的差异，可以通过电泳将异，可以通过电泳将其混合物中的不同成其混合物中的不同成分彼此分开。分彼此分开。 琼脂糖凝胶电泳基本原理琼脂糖凝胶电泳基本原理26 当用

17、当用EB对对DNA样品染色时，加入的样品染色时，加入的EB就插入就插入DNA分子分子中形成荧光结合物，中形成荧光结合物，荧光的强度与荧光的强度与DNA含量成正比含量成正比，如果用，如果用DNA片段的标准品片段的标准品作电泳对照，就可以作电泳对照，就可以估计出待测样品的分估计出待测样品的分子量大小和浓度。子量大小和浓度。27DNA的琼脂糖凝胶电泳检测的琼脂糖凝胶电泳检测 +-仪器仪器 电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、移液枪；电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、移液枪；药品药品 Agarose、 TAE buffer、EB（溴化乙锭）（溴化乙锭）上样缓冲液（上样缓冲液（6X）0.25% 溴酚蓝（指示溴酚蓝

18、（指示100-200bp的带）、的带）、0.25%二甲苯青（指示二甲苯青（指示800-100bp的带）、的带）、40%蔗糖；水溶液蔗糖；水溶液4保存。保存。28玻璃片29303132333435一、探针与探针标记一、探针与探针标记 杂交的主要目的是为了检测出同源杂交的主要目的是为了检测出同源DNA序序列，而为了达到这一目的，必需要有标记列，而为了达到这一目的，必需要有标记的探针。的探针。 带有能检测的标记物的带有能检测的标记物的DNA或或RNA叫探针。叫探针。 使使DNA或或RNA带有可检测的标记物的过程带有可检测的标记物的过程叫探针标记。叫探针标记。361.切口平移标记切口平移标记 用一定浓

19、度的用一定浓度的DNaseI在双链在双链DNA的一条链的一条链的有限位置上打开切口。的有限位置上打开切口。 利用利用DNA聚合酶聚合酶I的的5 3的核酸外切酶的核酸外切酶活性将活性将DNA一条链上的核苷酸一个一个的一条链上的核苷酸一个一个的切除，同时暴露出另一条单链切除，同时暴露出另一条单链DNA。 以这条单链以这条单链DNA为模板，利用为模板，利用DNA聚合酶聚合酶I的的5 3的的DNA聚合功能把一个一个带聚合功能把一个一个带有标记的有标记的dNTP合成上去。合成上去。3737 大肠杆菌聚合酶大肠杆菌聚合酶I的应用示例的应用示例缺口转移制备探针缺口转移制备探针Pol I + Mg2+32P

20、dNTPs382.随机引物标记随机引物标记 能与任何能与任何DNA模板的多个位点配对互补的模板的多个位点配对互补的多个不均一序列寡聚核苷酸多个不均一序列寡聚核苷酸DNA片段叫片段叫随随机引物。机引物。 DNA聚合酶聚合酶Klenow大片段能在随机引物的大片段能在随机引物的引导下以带有标记的引导下以带有标记的dNTP为原料合成新的为原料合成新的与模板与模板DNA互补的探针。互补的探针。39二、二、Southern杂交杂交40（a）（b）（c）（d）（e）基因组基因组DNADNA限制片段限制片段硝酸纤维素滤膜硝酸纤维素滤膜同探针同源杂交的基因同探针同源杂交的基因DNA片段片段X光底片光底片杂交步骤

21、：杂交步骤：1.酶切酶切2.电泳电泳(变性变性）3.转膜转膜(注意注意DNA要小于要小于2kb）4.封闭（预封闭（预杂交）杂交）5.杂交杂交6.显影显影41核酸杂交常用几种膜的性能比较核酸杂交常用几种膜的性能比较4243三、三、Northern杂交杂交44SouthernSouthern杂交和杂交和NorthernNorthern杂交的主要差别：杂交的主要差别：1.1.对象不同（对象不同（DNA/RNADNA/RNA）2.DNA2.DNA在凝胶电泳分离后，用碱处理变性，形在凝胶电泳分离后，用碱处理变性，形成单链。成单链。 RNARNA一般是进行变性电泳，在分离一般是进行变性电泳，在分离RNAR

22、NA的同时消除二级结构。的同时消除二级结构。 RNARNA变性电泳方法主要有甲醛变性电泳、变性电泳方法主要有甲醛变性电泳、羧甲基变性电泳和乙二醛变性电泳三种。羧甲基变性电泳和乙二醛变性电泳三种。45四、四、Western杂交杂交46原理原理47原理原理 而而SDS-PAGESDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。该技术最初由同就可以分开蛋白质。该技术最初由shapiroshapiro于于19671967年建立，他们发现在样品介年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳

23、迁移率主要还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小（可以忽略电荷取决于亚基分子量的大小（可以忽略电荷因素）。因素）。 48 十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfatesodium dodecyl sulfate，简称，简称SDSSDS）是一种阴离子去污剂，它能破坏蛋白质分子之）是一种阴离子去污剂，它能破坏蛋白质分子之间以及与其他物质分子之间的非共价键，使蛋白质变间以及与其他物质分子之间的非共价键，使蛋白质变性而改变原有的空间构象。特别是在强还原剂，如巯性而改变原有的空间构象。特别是在强还原剂，如巯基乙醇存在下，由于蛋白质分子内的二硫键被还原剂

24、基乙醇存在下，由于蛋白质分子内的二硫键被还原剂打开，不易再氧化，这就保证了蛋白质分子与打开，不易再氧化，这就保证了蛋白质分子与SDSSDS充充分结合分结合. . 蛋白质蛋白质-SDS-SDS复合物在水溶液中的形状，近似于雪茄烟复合物在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒。不同蛋白质的形的长椭圆棒。不同蛋白质的SDSSDS复合物的短轴长度复合物的短轴长度都一样，约为都一样，约为1.8nm1.8nm，而长轴则随蛋白质的分子量成，而长轴则随蛋白质的分子量成正比变化。这样的蛋白质正比变化。这样的蛋白质-SDS-SDS复合物在凝胶中的迁移复合物在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只

25、是椭率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是椭圆棒的长度，也就是蛋白质分子量的函数。圆棒的长度，也就是蛋白质分子量的函数。 带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质-SDS-SDS复合物由于结合了大量的复合物由于结合了大量的SDSSDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态，形成了仅保持原有使蛋白质丧失了原有的电荷状态，形成了仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异。种蛋白质分子之间天然的电荷差异。原理原理49实验原理实验原理 PAGEPAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续

26、系统两大类，连续系统电泳体系和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液中缓冲液pHpH值及凝胶浓度相同，带电颗粒值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中由于缓冲液离子成分，不连续系统中由于缓冲液离子成分，pHpH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。清晰度及分辨率均较前者佳。50 分离胶分离胶(10%.5ml) 浓缩

27、胶浓缩胶(5%.3ml) H2O 2.6ml 0.7ml 30%Acr 1.7ml 1.5ml Buffer 3.0mol/L pH=8.8 Tris-HCl 0.6ml 0.5mol/L pH=6.8 Tris-HCl 0.75ml 10%SDS 0.05ml 0.03ml 10%Ap 0.05ml 0.03ml TEMED 5l 4l 各部分凝胶配制各部分凝胶配制51 实验过程实验过程 1.1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干将玻璃板用蒸馏水洗净晾干, , 准备准备2 2个干净的个干净的锥形瓶锥形瓶. .2.2.把玻璃板在灌胶支架上固定好把玻璃板在灌胶支架上固定好. .固定玻璃板时，两边用力一定要

28、均匀，防止夹固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板坏玻璃板. .3.3.按比例配好分离胶按比例配好分离胶, ,用移液管快速加入用移液管快速加入, ,大约大约5 5厘米左右厘米左右, ,之后加少许蒸馏水之后加少许蒸馏水, ,静置静置4040分钟分钟. .凝胶配制过程要迅速凝胶配制过程要迅速, , 催化剂催化剂TEMEDTEMED要在注胶要在注胶前再加入前再加入, ,否则凝结无法注胶否则凝结无法注胶. .注胶过程最好一次注胶过程最好一次性完成性完成, ,避免产生气泡避免产生气泡. .52 实验过程实验过程. . 水封的目的是为了使分离胶上延平直，并排除水封的目的是为了使分离胶上延平直，并

29、排除气泡气泡 凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面界面. .4.4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干, ,按比例配好按比例配好浓缩胶浓缩胶, ,连续平稳加入浓缩胶至离边缘连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm5mm处处, ,迅速迅速插入样梳插入样梳, ,静置静置4040分钟分钟. . 样梳需一次平稳插入样梳需一次平稳插入, ,梳口处不得有气泡梳口处不得有气泡, ,梳底梳底需水平需水平. .53实验过程实验过程5.5.拔出样梳后拔出样梳后, ,在上槽内加入缓冲液在上槽内加入缓冲液, ,没过锯齿时可拆去没过锯齿时可拆去 底端的琼

30、脂糖底端的琼脂糖. . 要使锯齿孔内的气泡全部排出要使锯齿孔内的气泡全部排出, ,否则会影响加样效果否则会影响加样效果. .6 6、加样三个。加样三个。 （1）取）取10l标准蛋白溶解液于标准蛋白溶解液于EP管内，再管内，再加入加入10l 2倍样品缓冲液，上样量为倍样品缓冲液，上样量为20l。 （2）取）取10l样品样品1溶液，再加入溶液，再加入10l 2倍样品缓冲液，上样倍样品缓冲液，上样量分别为量分别为5l 和和10l。7.7.用微量注射器距槽底三分之一处进样用微量注射器距槽底三分之一处进样, ,加样前加样前, ,样品在样品在 沸水中加热沸水中加热3 3分钟，去掉亚稳态聚合。分钟，去掉亚稳

31、态聚合。 注射器不可过低注射器不可过低, ,以防刺破胶体以防刺破胶体, ,也不可过高也不可过高, ,在样下在样下 沉时会发生扩散沉时会发生扩散. . 为避免边缘效应为避免边缘效应, ,最好选用中部的孔注样最好选用中部的孔注样. .54实验过程实验过程8.8.电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒定在定在10mA，当进入分离胶后改为，当进入分离胶后改为20mA，溴酚蓝距凝胶边缘，溴酚蓝距凝胶边缘约约5mm时，停止电泳。时，停止电泳。 9.9.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将

32、凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色1小时左右。小时左右。10.10.脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰。色，直到蛋白质区带清晰。 剥胶时要小心剥胶时要小心, ,保持胶完好无损保持胶完好无损, ,染色要充分染色要充分.11.11.实验结果分析实验结果分析。5556五、菌落原位杂交五、菌落原位杂交5758第三节、第三节、PCR技术技术59 60一、一、PCR技术的基本成分技术的基本成分 PCR的成分包括：待扩增的模板、引的成分包括：待扩增的模板、引物、物、

33、DNA聚合酶、四种脱氧核苷酸的混合聚合酶、四种脱氧核苷酸的混合物以及反应缓冲液。物以及反应缓冲液。 模板是含有待扩增序列的模板是含有待扩增序列的DNA或从或从mRNA反转录来的反转录来的cDNA。61()40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 2062Taq DNA聚合酶聚合酶CharacteristicsDescriptionOriginMolecular weightOptimal temperatureActivityStabilityFidelityMg2+ concentrationExonuclease activityTransferase activ

34、ityThermus aquaticus strain YT194 kd72-80150 nucleotides/sec/molecule50% at 95 for 40 min1.110-4 substitutions per cycle0.5mM10mM5 to 3only5 adenosines63PCR的引物的引物 是指与待扩增的靶是指与待扩增的靶DNA区段两端序列互补的人区段两端序列互补的人工合成的寡核苷酸片断。工合成的寡核苷酸片断。64引物的设计原则：引物的设计原则： 1. 1.引物碱基引物碱基G GC C含量以含量以45%45%55%55%为宜。为宜。 2.2.其长度通常在其长度

35、通常在15301530个核苷酸之间。个核苷酸之间。 3.Tm3.Tm值应高于值应高于5555。 引物的另一个重要参数是熔解温度（引物的另一个重要参数是熔解温度（TmTm）。这是当）。这是当5050的引物和互补序列表现为双链的引物和互补序列表现为双链DNADNA分子时的温度分子时的温度.Tm.Tm对对于设定于设定 PCRPCR退火温度是必需的。在理想状态下，退火温退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，度足够低，以保证引物同目的序列有效退火， 同时还同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55 55

36、到到7070。退火温度一般设定比引退火温度一般设定比引物的物的 TmTm低低55。 2 2个引个引物要有近似的物要有近似的TmTm值，以值，以免相差太大，引起非特免相差太大，引起非特异性扩增；一般退火温异性扩增；一般退火温度为最高度为最高TmTm值的引物温值的引物温度减度减5.5.654.PCR扩增的长度一般：扩增的长度一般：GTGCACA。即当引物。即当引物33末端为末端为A A时，即使有错配碱基也最不易延时，即使有错配碱基也最不易延伸，所以引物设计时可将伸，所以引物设计时可将33末端设计为末端设计为A A，以提高复制精确，以提高复制精确性。另一种理论是性。另一种理论是33末端应设计为末端应

37、设计为G G或或C C，因为，因为G G和和C C的氢键多的氢键多于于A A与与T T，能更好地与模板结合开始，能更好地与模板结合开始DNADNA合成，当然对错配延伸合成，当然对错配延伸效率方面就不能苛求了。总而言之，引物的效率方面就不能苛求了。总而言之，引物的33末端不要考虑末端不要考虑使用使用T T。 6.尽量减少自身配对。尽量减少自身配对。 7.避免两条引物互补。避免两条引物互补。 8.引物要特异。引物要特异。 9.可以在引物的可以在引物的5端加上合适的酶切位点。端加上合适的酶切位点。一般引物自身配对一般引物自身配对形成茎环结构，茎形成茎环结构，茎的碱基对数不大于的碱基对数不大于3 3，

38、两条引物间配，两条引物间配对碱基数小于对碱基数小于5 5个。个。66http:/www-bin/primer/primer3_www.cgi 引物设计网址：引物设计网址：67反应条件反应条件 1 1PCRPCR缓冲液缓冲液 常用的常用的1 1PCRPCR缓冲液为缓冲液为10mmol10mmolL L Tris-HCl pH8.3(Tris-HCl pH8.3(常温常温) )，50mmol50mmolL KClL KCl，1.5mmol1.5mmolL MgCl2L MgCl2。由试剂公司与。由试剂公司与TaqTaq酶一起提供。酶一起提供。 (1)Mg2+(1)Mg2+离子浓度：离子浓度：Mg2

39、+Mg2+离子浓度对离子浓度对PCRPCR反应反应影响很大，因为影响很大，因为Mg2+Mg2+与引物与引物- -模板及产物的解链模板及产物的解链温度、产物的特异性、引物二聚体的生成、产物温度、产物的特异性、引物二聚体的生成、产物的忠实性、酶活力、产物的产量等诸多因素有关。的忠实性、酶活力、产物的产量等诸多因素有关。Mg2+Mg2+一般使用浓度为一般使用浓度为0.50.52.5mmol2.5mmolL L，必要时可，必要时可以以0.5mmol0.5mmolL L梯度间隔做梯度间隔做Mg2+Mg2+最适浓度试验。最适浓度试验。68 (2)dNTP(2)dNTP：常用：常用dNTPdNTP浓度为浓度

40、为20mol20molL(L(可可用范围为用范围为2020200mol200molL)L)。dNTPdNTP的用量的用量与与PCRPCR产量及产物忠实性有关，产量及产物忠实性有关，dNTPdNTP量过少量过少时合成的产物减少。时合成的产物减少。 (3)K(3)K+ +离子浓度：离子浓度：PCRPCR反应中反应中K K+ +离子的作用是离子的作用是促进促进TaqTaq酶活力与促进引物退火，一般使用酶活力与促进引物退火，一般使用浓度是浓度是50mmol50mmolL L，但当，但当K K+ +离子浓度高于离子浓度高于50mmol50mmolL L时会抑制时会抑制TaqTaq酶活力。酶活力。69 2

41、 2模板模板 PCRPCR模板可以是模板可以是DNADNA或或RNARNA，RNARNA需反转录需反转录后再扩增。模板可以是基因组后再扩增。模板可以是基因组DNADNA或纯化的质粒或纯化的质粒DNADNA，当然两者的，当然两者的DNADNA量在量在PCRPCR起始模板中相差很大。起始模板中相差很大。每个每个PCRPCR反应中加入的模板数量可在反应中加入的模板数量可在102102105105分子分子之间，必要时可低至之间，必要时可低至5050个分子，模板的量少时应个分子，模板的量少时应酌情增加循环次数。小于酌情增加循环次数。小于100ng100ng的哺乳动物细胞基的哺乳动物细胞基因组因组DNA(

42、DNA(相当于约相当于约104104个细胞个细胞) )，经，经3030个循环，个循环，1010的反应物应能够在溴化乙锭染色的凝胶上看到的反应物应能够在溴化乙锭染色的凝胶上看到一条主要产物带。使用较大量的模板时，循环数一条主要产物带。使用较大量的模板时，循环数可减少；如果模板量很少，可能需要增加至可减少；如果模板量很少，可能需要增加至4545个个循环反应。循环反应。70 3 3引物浓度引物浓度 常用引物浓度为常用引物浓度为0.10.10.5mol0.5molL L。随着引物浓度的降低，。随着引物浓度的降低，PCRPCR反应的特异性提高但产物得率降低；随着反应的特异性提高但产物得率降低；随着引物浓

43、度的升高，情况正好相反。引物浓度的升高，情况正好相反。71二、二、PCR技术的原理和过程技术的原理和过程 947260？主要是为了保险主要是为了保险起见，使模板起见，使模板DNA的二级结构的二级结构充分打开。充分打开。有些化学修饰的有些化学修饰的热启动酶这一步热启动酶这一步时间还要长，目时间还要长，目的是充分释放酶的是充分释放酶活活 727374PCR 扩增过程中片段增殖的计算扩增过程中片段增殖的计算75PCR反应体系的确立反应体系的确立WaterBuffer（10）Mg+（25mM）dNTPs（10mM）Primer1（10uM）Primer2（10uM）Taq（5U/uL）Templets

44、12.821.60.4110.2120uL反应体系中各成分的母液浓度及加入量反应体系中各成分的母液浓度及加入量PCR扩增程序举例扩增程序举例Tem.9494607272Time00:08:0000:00:3000:00:4000:01:0000:07:00Cycles3076经典循环参数（500bp以内）30次77PCR扩增结果分析举例扩增结果分析举例 M 1 2 3 4 5 6 7 MM, marker;1-2, PCR for CP4-EPSPS gene; 3-4, PCR for 35S Promoter; 5-6, PCR for lectin gene; 7, Negtive co

45、ntrol.78 无扩增产物 非特异性扩增 拖尾 假阳性79无扩增产物模板模板: :含有抑制物，含量低含有抑制物，含量低BufferBuffer对样品不合适对样品不合适引物设计不当或者发生降引物设计不当或者发生降解解反应条件：反应条件：退火温度太高，延退火温度太高，延伸时间太短伸时间太短 原原因因对对策策纯化模板或者使用试剂盒提取纯化模板或者使用试剂盒提取模板模板DNADNA或加大模板的用量或加大模板的用量更换更换BufferBuffer或调整浓度或调整浓度重新设计引物（避免链间二聚重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一体和链内二级结构）或者换一管新引物管新引物降低退火温度、延长

46、延伸时间降低退火温度、延长延伸时间现象：正对照有条带，而样品则无正对照有条带，而样品则无；80 非特异性扩增非特异性扩增 现象：现象：PCRPCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。81引物特异性差引物特异性差模板或引物浓度过高模板或引物浓度过高酶量过多酶量过多MgMg2+2+浓度偏高浓度偏高退火温度偏低退火温度偏低循环次数过多循环次数过多 原原因因对对策策重新设计引物或者使用巢重新设计引物或者使用巢式式PCRPCR适当降低模板或引物浓度适当降低模板或引物

47、浓度适当减少酶量适当减少酶量降低镁离子浓度降低镁离子浓度适当提高退火温度或使用适当提高退火温度或使用二阶段温度法二阶段温度法减少循环次数减少循环次数 非特异性扩增82 拖尾 现象：现象：产物在凝胶上呈产物在凝胶上呈Smear状态状态。 M 1 283模板不纯模板不纯BufferBuffer不合适不合适退火温度偏低退火温度偏低酶量过多酶量过多dNTPdNTP、MgMg2+2+浓度偏高浓度偏高循环次数过多循环次数过多 原原因因对对策策纯化模板纯化模板更换更换BufferBuffer适当提高退火温度适当提高退火温度适量用酶适量用酶适当降低适当降低dNTPdNTP和镁离子的和镁离子的浓度浓度减少循环次

48、数减少循环次数 拖尾84 假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况（筛选转基因、检测基因表达情况) ) 原因：靶序列或扩增产物的交叉污染靶序列或扩增产物的交叉污染 现象：空白对照出现目的扩增产物空白对照出现目的扩增产物 对策：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。及加样枪头等均应一次性使用。各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。

49、85三、荧光定量三、荧光定量PCR 是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程结合相应软件可以对产物进行分反应过程结合相应软件可以对产物进行分析，计算待测样品的初始模板量。析，计算待测样品的初始模板量。 荧光定量荧光定量PCR仪是一种带有激发光源和荧仪是一种带有激发光源和荧光信号检测系统的光信号检测系统的PCR仪，通常配有电脑仪，通常配有电脑系统及相应的软件。系统及相应的软件。 标记方法主要有：内插染料标记方法主要有：内插染料 、双标记探针、双标记探针、分子信标等。分子信标等。86S

50、YBR GREEN ISYBR GREEN I1、SYBR Green 法法8788SYBR Green 熔解曲线分析熔解曲线分析892、TaqMan探针法探针法90TaqMan作用机理作用机理9192荧光定量荧光定量PCR的优点的优点1.全封闭的全封闭的PCR过程，无需跑胶。过程，无需跑胶。2.采用采用dUTPUNG酶防污染，有效降低污染机会。酶防污染，有效降低污染机会。原理：原理：UNG酶的作用原理是选择性水解断裂含有酶的作用原理是选择性水解断裂含有dU的双链或单链的双链或单链DNA中的尿嘧啶糖苷键，形成的有缺失碱基的中的尿嘧啶糖苷键，形成的有缺失碱基的DNA链，在碱性介质以链，在碱性介质